生物制造過程的系統(tǒng)化研究策略和幾個(gè)關(guān)鍵問題的探索.pdf

1、用系統(tǒng)的數(shù)據(jù)和理論體系指導(dǎo)生物產(chǎn)品分離純化、制造工藝和研發(fā)設(shè)計(jì)是生物化工領(lǐng)域科學(xué)家和工程師的一個(gè)夢(mèng)想和終極目標(biāo)，是當(dāng)前的一個(gè)重要的科學(xué)前沿，也是蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大需求。建立生物加工過程的系統(tǒng)化研究策略，為生物化工分離純化各單元操作的基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)定積累，建立統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù)和理論體系，不僅是學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)，更是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。
　　 目前建立蛋白質(zhì)分離純化工藝的研發(fā)策略仍然是逐個(gè)蛋白產(chǎn)品單獨(dú)進(jìn)行，而且?guī)缀跬耆蕾噷?shí)驗(yàn)方法，結(jié)果是

2、本領(lǐng)域的研究資料以描述型和經(jīng)驗(yàn)型為主，數(shù)據(jù)分散在每篇研究論文中，不成體系，也難以系統(tǒng)地總結(jié)歸納。生物加工過程的系統(tǒng)化研究旨在挖掘生物產(chǎn)品在生物制造單元中的行為規(guī)律，系統(tǒng)的表述規(guī)律，并利用規(guī)律指導(dǎo)工藝建立、優(yōu)化和規(guī)模生產(chǎn)。這項(xiàng)研究具有研究對(duì)象寬泛，包括了典型生物產(chǎn)品和宿主背景物質(zhì);實(shí)驗(yàn)方式統(tǒng)一且高通量，方便建立統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫(kù);數(shù)據(jù)量大，需要挖掘數(shù)據(jù)中的規(guī)律以使其被系統(tǒng)利用;簡(jiǎn)明的表述方式，以降低規(guī)律模型利用的難度。
　　 本課題圍繞著

3、生物制造過程的系統(tǒng)化研究策略建立這一目標(biāo)，利用四個(gè)實(shí)例探索了以下三個(gè)關(guān)鍵問題:
　　 1)生物產(chǎn)品在生物制造單元中的行為規(guī)律如何高效的獲取?
　　 2)生物產(chǎn)品在生物制造單元中的應(yīng)對(duì)工藝條件的耐受度如何測(cè)定?
　　 3)生物產(chǎn)品在生物制造單元中行為規(guī)律如何表述和利用?
　　 在第一章中，我們借鑒超微系統(tǒng)(Ultra scale-down)的研究理念，利用TR-PCR，在使用極少物料，較短時(shí)間的情況下，研究

4、了大腸桿菌工程菌質(zhì)粒DNA和染色體DNA受熱釋放的規(guī)律。質(zhì)粒DNA和染色體DNA釋放量隨溫度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但在兩者達(dá)到相同釋放量所需的溫度和時(shí)間存在顯著差異;在各處理溫度下質(zhì)粒DNA和染色體DNA的釋放量均可被一階方程擬合，兩者的擬合參數(shù)亦呈現(xiàn)顯著差異。通過對(duì)質(zhì)粒DNA和染色體DNA受熱釋放模型的操作界面化(Windows of Operation)，模型能夠被有效利用指導(dǎo)規(guī)模生產(chǎn)。
　　 在第二章中，依舊利用TR-

5、PCR和熒光標(biāo)記辦法，我們考察了熒光標(biāo)記蛋白的熱可逆耐受規(guī)律。蛋白質(zhì)存在可逆耐受溫度閾值，表現(xiàn)在在閾值溫度以下，蛋白熒光的升溫軌跡和降溫軌跡可以重合，閾值溫度以上熒光的升溫軌跡和降溫軌跡不能重合，且軌跡之間的差異隨處理溫度升高而加大。對(duì)各處理溫度下熒光軌跡進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，熒光軌跡的變化規(guī)律與各溫度處理下蛋白質(zhì)活性的殘留率成正相關(guān)。課題建立的蛋白耐受度測(cè)定方法首次將蛋白耐受值與蛋白質(zhì)生物活性關(guān)聯(lián)起來(lái)。
　　 在第三章中，我們利用前

6、期建立的mRNA快速定量技術(shù)和積累的(數(shù))了mRNA作為細(xì)菌產(chǎn)生的一種中間產(chǎn)物，以經(jīng)典的Logistic和Luedeking-Piret方程為基礎(chǔ)，建立動(dòng)力學(xué)模型，較好的描述了生物量，mRNA豐度與產(chǎn)物濃度的變化規(guī)律?；谠撃Ｐ停瑢RNA的形成速率與產(chǎn)物的形成速率關(guān)聯(lián)發(fā)現(xiàn)，從菌體對(duì)數(shù)初期到對(duì)數(shù)中期兩者成正相關(guān)，mRNA的形成快速激發(fā)了產(chǎn)物形成;對(duì)數(shù)中期后，mRNA形成可能受PCA高濃度抑制快速降低，但PCA的生成速率沒有同比例降低，而

7、是緩慢降低，提示可能存在phzC mRNA之外的后期調(diào)控以防止PCA合成的過快終止。
　　 在第四章中，我們使用蛋白組學(xué)分析方法和典型基因工程宿主大腸桿菌抽提蛋白樣品，建立復(fù)雜蛋白組分體系高通量等電點(diǎn)沉淀測(cè)定方法，并研究大腸桿菌抽提蛋白等電點(diǎn)沉淀規(guī)律。發(fā)現(xiàn)大腸桿菌蛋白在等電點(diǎn)沉淀過程中的行為表現(xiàn)既有符合經(jīng)典等電沉淀理論的:即大腸桿菌蛋白組在各個(gè)pH操作條件下所得蛋白沉淀量與大腸桿菌蛋白組理論pⅠ分布趨勢(shì)基本吻合;也有偏離經(jīng)典等點(diǎn)

8、沉淀理論的行為:在對(duì)各酸性等電點(diǎn)沉淀操作條件下的高豐度蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)有45％的蛋白在其理論等電點(diǎn)左右（理論pⅠ±0.5）檢測(cè)到的肽段數(shù)最多，符合等電點(diǎn)沉淀理論。有55％的蛋白在其理論pⅠ附近（理論pⅠ±0.5）并無(wú)最多沉淀，不符合等電點(diǎn)沉淀理論。觀察符合等電點(diǎn)沉淀理論蛋白的分子量、Gravy value與理論pⅠ分布較分散，且不存在明顯規(guī)律;而不符合等電點(diǎn)沉淀蛋白的Gravy value與理論pⅠ有明顯的相關(guān)性且可被模型描述。