基因改造和馴化細(xì)菌利用水葫蘆發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的機(jī)理研究.pdf

1、隨著化石能源的日益短缺和環(huán)保要求的逐漸提高，氫能作為清潔、高效的可再生能源載體越來(lái)越受到人們的重視。利用生物質(zhì)原料通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵方法制取氫氣新能源具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景，而通過(guò)基因工程和代謝調(diào)控手段改造產(chǎn)氫細(xì)菌是生物制氫領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文在國(guó)際上首次測(cè)得陰溝腸桿菌在過(guò)表達(dá)產(chǎn)氫增強(qiáng)基因后的氫酶活性提高了97.4％，利用混合菌群馴化和微波稀酸水解聯(lián)合活性炭脫毒使水葫蘆發(fā)酵產(chǎn)氫量提高了111.1％；500升半連續(xù)中試得到水葫蘆發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的

2、能源轉(zhuǎn)化效率達(dá)到51.3％。
　　本文首先以高效產(chǎn)氫細(xì)菌陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae CICC10017和產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes ATCC13408為主要研究對(duì)象，對(duì)其過(guò)表達(dá)外源產(chǎn)氫增強(qiáng)基因后的氫酶活性、利用葡萄糖的產(chǎn)氫能力和代謝途徑進(jìn)行了研究。陰溝腸桿菌E.cloacae CICC10017在過(guò)表達(dá)了一種產(chǎn)氫增強(qiáng)基因后，氫酶活性由原來(lái)的270.93 ml-H2/(g-DW·h

3、)提高到了534.78 ml-H2/(g-DW·h)，單位底物產(chǎn)氫量也由1.29 mol-H2/mol-葡萄糖提高到了2.54mol-H2/mol-葡萄糖，產(chǎn)氫量提高了97.9％。改造菌的發(fā)酵液中乙酸和丁酸的產(chǎn)量增加，乙醇產(chǎn)量減少，這與產(chǎn)氫量高時(shí)的NADH代謝機(jī)理是一致的。產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes ATCC13408在過(guò)表達(dá)氫酶hyc操縱子大、小亞基的基因后，氫酶活性分別提高了124％和67％，氫氣產(chǎn)量也由1

4、.16 mol-H2/mol-葡萄糖分別提高至2.16 mol-H2/mol-葡萄糖和1.97mol-H2/mol-葡萄糖；在過(guò)表達(dá)了藍(lán)藻Synechocystis Sp.PCC6803氫酶hoxUYH基因后，氫酶活性提高了153.8％，氫氣產(chǎn)量由1.27 mol-H2/mol-葡萄糖提高到2.39 mol-H2/mol-葡萄糖。在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了基因改造細(xì)菌利用預(yù)處理水葫蘆產(chǎn)氫的實(shí)驗(yàn)研究，過(guò)表達(dá)產(chǎn)氫增強(qiáng)基因后的陰溝腸桿菌利用水葫蘆產(chǎn)氫

5、能力最高，產(chǎn)量為74.9 ml-H2/g-TVS。
　　本文針對(duì)木質(zhì)纖維素、蛋白質(zhì)和油脂等三大類(lèi)復(fù)雜有機(jī)物的發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷特性開(kāi)展了研究。利用生物質(zhì)原料對(duì)混合菌群進(jìn)行馴化培養(yǎng)加強(qiáng)優(yōu)勢(shì)菌種的適應(yīng)性。對(duì)大分子有機(jī)物強(qiáng)化水解得到易于發(fā)酵的小分子原料。16S rDNA分析結(jié)果表明，混合菌種經(jīng)過(guò)木糖馴化培養(yǎng)富集，種群多樣性更高，多種梭菌屬并存為優(yōu)勢(shì)菌種，種群多樣性提高使木糖的產(chǎn)氫量提高了45％。木糖聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷量為190.6 ml-H

6、2/g-木糖和216.5 ml-CH4/g-木糖，聯(lián)產(chǎn)的能源轉(zhuǎn)化率達(dá)67.48％。乳蛋白聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷量為136.5 ml-H2/g-TVS和157.8ml-CH4/g-TVS，聯(lián)產(chǎn)的能源轉(zhuǎn)化效率為41.9％。
　　水葫蘆經(jīng)過(guò)稀酸/微波/酶預(yù)處理工藝，其水解糖化率可以達(dá)到91.36％，從而使水葫蘆發(fā)酵產(chǎn)氫量比常規(guī)的酶水解顯著提高了62.8％，而采用混合菌群馴化后使水葫蘆發(fā)酵產(chǎn)氫量提高了95.5％，進(jìn)一步使用活性炭脫毒后使水葫蘆發(fā)酵

7、產(chǎn)氫量提高了111.1％。水葫蘆暗發(fā)酵得到氫氣產(chǎn)量為134.9 ml-H2/g-TVS，利用其產(chǎn)氫廢液繼續(xù)聯(lián)產(chǎn)甲烷量為107.7ml-CH4/g-TVS。利用50升和500升的兩個(gè)串聯(lián)發(fā)酵罐實(shí)現(xiàn)了水葫蘆發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)H2和CH4的半連續(xù)流中試，得到連續(xù)穩(wěn)定的氫氣和甲烷產(chǎn)生速率分別為340.9±36.6 m1-H2/(L·d)和184.3±10.4 ml.CH4/(L·d)。利用混合菌群馴化和微波稀酸水解使水葫蘆中試聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的能源轉(zhuǎn)化效率