嗜酸硫桿菌硫代謝在硫化礦浸出中作用及其關(guān)鍵酶性質(zhì)研究.pdf

1、本論文比較了不同能量代謝的嗜酸硫桿菌A.ferrooxidans菌、A.thiobacillus菌對(duì)閃鋅礦單獨(dú)和混合浸出行為：?jiǎn)为?dú)的氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌浸出18天，鋅浸出率分別為61％和20％，浸出速度分別為0.17g/L. day0.06g/L.day?；旌辖鰰r(shí)，鋅浸出率和浸出速度分別達(dá)到了97％和0.3g/L.day。浸出殘?jiān)治霰砻鳎涸跓o菌或僅有氧化亞鐵硫桿菌的浸出體系的殘?jiān)砻娲嬖谥亓蚰ぁＨ欢?，在氧化硫硫桿菌的浸出

2、體系中礦物殘?jiān)砻鏇]有硫的覆蓋。結(jié)合各自的浸出率表明，這些硫膜阻礙了細(xì)菌與礦物表面的直接接觸，降低了鋅的浸出。氧化亞鐵硫桿菌能夠不斷地補(bǔ)充浸出過程中被消耗的高價(jià)鐵，使溶液保持一個(gè)高的氧化還原電位，從而使生物浸出能得以繼續(xù)。氧化硫硫桿菌的角色是使元素硫膜氧化成為硫酸，消除了元素硫膜這一“鈍化層”，加速酸浸效果，降低浸出體系pH，抑制鐵礬的形成，有利于閃鋅礦的化學(xué)性浸出。 通過A.caldus在Cu2+脅迫環(huán)境下生長(zhǎng)行為表明，Cu2

3、+毒性能夠表現(xiàn)在抑制細(xì)菌的呼吸作用及參與能量代謝的酶活性。在銅離子加入培養(yǎng)基后，對(duì)呼吸作用的抑制有約30分鐘的延遲效應(yīng)。當(dāng)A.caldus生長(zhǎng)在以硫單質(zhì)為能源時(shí)，Cu2+影響細(xì)菌硫代謝中的亞硫酸氧化酶和APS還原酶的活性，對(duì)其他幾種被調(diào)查的酶沒有明顯的抑制作用，進(jìn)一步的試驗(yàn)表明Cu2+對(duì)酶的抑制作用是一種間接行為，表現(xiàn)為一種負(fù)相關(guān)性。分離和測(cè)定A.caldus各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分的酶活及隨pH的酶活性變化表明，所研究的五種硫代謝酶均位于A.

4、caldus的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)膜上。蛋白酶和纈氨霉素處理細(xì)菌表明，A.caldus能夠通過膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用將胞內(nèi)Cu2+轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，從而維持著胞內(nèi)較低的Cu2+濃度，并且這種轉(zhuǎn)運(yùn)過程是與能量的消耗相關(guān)聯(lián)。其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類似于ATP泵的作用。 從A.ferrooxidans ATCC23270基因組中克隆并證實(shí)了一個(gè)尚未注明功能的基因，其表達(dá)產(chǎn)物能將硫化物中電子傳遞給cytochromec，因而證明該基因?yàn)榱蚧锩摎涿富?。該?/p>

5、在中性pH活性最高，暗示可能位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)膜。 該基因在起始密碼子的上游7個(gè)堿基處有典型的GGAG序列(核糖體結(jié)合位點(diǎn))但無典型的-10區(qū)和-35區(qū)結(jié)構(gòu)。編碼的氨基酸序列與其 它細(xì)菌來源的同源蛋白均含有結(jié)合FAD輔基的保守結(jié)合區(qū)和含保守的兩個(gè)半胱氨酸，后者通過形成和解除二硫鍵，從而結(jié)合硫化氫使之成為活性位點(diǎn)。與SQR在氨基酸序列上有很高的同源性(39％)，在N末端包含βαβ結(jié)構(gòu)域、保守的FAD結(jié)合區(qū)及與硫化物氧化有關(guān)

6、的保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)。 半定量和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：相同能源下，F(xiàn)CSD的mRNA表達(dá)豐度明顯高于SQR。在不同能源下，他們?cè)趤嗚F培養(yǎng)下的mRNA表達(dá)豐度均高于單質(zhì)硫和硫代硫酸鈉培養(yǎng)下的mRNA表達(dá)豐度。然而，他們的蛋白酶的活性，以單質(zhì)硫培養(yǎng)的酶活性最高，其次是亞鐵培養(yǎng)的，活性最小的為硫代硫酸鈉培養(yǎng)。這表明兩個(gè)基因的表達(dá)即受到mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，更重要的受到蛋白質(zhì)翻譯水平的調(diào)控。最終的蛋白酶活性測(cè)定顯示FCSD和SQ

7、R在以單質(zhì)硫培養(yǎng)的菌體內(nèi)含有較其它能源培養(yǎng)高的酶活性，表明兩者均參與了單質(zhì)硫的氧化代謝。結(jié)合同工酶SQR的定位推測(cè)，兩種酶在催化硫化氫的氧化時(shí)可能扮演了不同的角色，前者負(fù)責(zé)胞內(nèi)硫化氫氧化，后者負(fù)責(zé)胞外硫化氫氧化。基于16s序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，兩個(gè)基因均出現(xiàn)在從古菌到真細(xì)菌的廣大分布領(lǐng)域。他們均是一個(gè)出現(xiàn)較古老的參與硫代謝酶基因。FCSD的分布大于SQR的分布范圍。從分布廣度和mRNA表達(dá)豐度分析，F(xiàn)CSD在進(jìn)化地位和對(duì)細(xì)菌硫代謝的貢獻(xiàn)可

8、能大于SQR。 基于Chromatium vinosum的硫化物脫氫酶的同源模建表明，在A.ferrooxidans菌中硫化物脫氫酶中的氨基酸Cys158和Cys331參與二硫鍵的形成，該二硫鍵的成鍵與解鍵對(duì)酶與硫化物的結(jié)合與酶的催化扮演重要角色。另外，在FAD周圍，推測(cè)Gly298，Ser299，Phe330，Phe332參與了蛋白質(zhì)與輔基FAD之間的電子傳遞，Glu164與接收電子有關(guān)。對(duì)定點(diǎn)突變酶E164A，S299A活性

9、測(cè)定表明：突變酶活性與非突變酶相比有很大的降低。證實(shí)上述推理的合理性，這幾個(gè)氨基酸在硫化物的氧化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 構(gòu)建了硫化物脫氫酶/納米金/半胱氨酸/金修飾電極。該修飾電極在0.02mol/L PBS buffer(pH7.4)溶液中循環(huán)伏安掃描可見一對(duì)穩(wěn)定、準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，其陽極峰電位( Epa)和陰極峰電位(Epc)分別為0.13V和-0.034V，式電位EO’=(Epa+ Epc)/2=63mV。加入硫化鈉到測(cè)

10、試底液后，修飾電極氧化峰電流增強(qiáng)，還原峰電流減弱，表明固定在電極表面的硫化物脫氫酶對(duì)Na2S有電化學(xué)催化作用。對(duì)硫化鈉濃度的計(jì)時(shí)響應(yīng)表明，修飾電極對(duì)底物硫化物電化學(xué)響應(yīng)迅速，在平均4s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流95％。在2×10-4.2.5×10-3 mol/L范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與硫化鈉濃度呈線性關(guān)系，其線性回歸方程：ip=0.4819+2.64c，相關(guān)系數(shù)為0.992，最低檢測(cè)下限1.1×10-5 mol/L。固定在電極表面的酶的kmapp為4.5

11、mmol/L。Fe3+(1.5×10-3mol/L)、K+(1.sxio-3mol/L)、NO3'(1.5×10-3mol/L)、SO42-(1.5×10-3mol/L)、檸檬酸(1.5×10-3mol/L)、葡萄糖(1.5×10-3mol/L)等六種物質(zhì)對(duì)硫化鈉的干擾很小，電極選擇性高。考察了不同時(shí)間和批次的修飾電極對(duì)同一濃度的硫化鈉(6.0×10-4 mol/L)的響應(yīng)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<5％，表明修飾電極有良好的重現(xiàn)性和較好的穩(wěn)