油藏微生物群落多態(tài)性分析及高溫解烴菌的性能研究.pdf

1、外源微生物采油技術(shù)有重復(fù)性差和持續(xù)時(shí)間短等缺陷。存在這些問題的關(guān)鍵就是外源微生物的配伍比較盲目，沒有理論指導(dǎo)和配伍標(biāo)準(zhǔn)，從而對(duì)內(nèi)源微生物激活不具有很好針對(duì)性，究其原因主要是缺乏對(duì)采油過程中油藏微生物群落結(jié)構(gòu)的了解。采用分子生態(tài)學(xué)方法對(duì)高溫油藏的微生物群落進(jìn)行多樣性分析，并將得到的信息用于指導(dǎo)油藏微生物的分離是一項(xiàng)十分重要的工作。
　　 本文分別用兩種方法提取了油田采出水中的細(xì)菌總DNA，采用16S rDNAV3、V8、V9三個(gè)高

2、可變區(qū)的引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行了變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析。結(jié)果表明，采用酶法和化學(xué)法結(jié)合的方法提取水樣中的總DNA，即可得到完整的DNA樣品，經(jīng)PCR-DGGE分析后能夠得到較多的DNA條帶；采用V9區(qū)引物擴(kuò)增比V3和V8區(qū)引物能夠得到較多的DNA條帶，從而分析到更多的微生物信息。對(duì)水樣中優(yōu)勢(shì)條帶序列分析表明，在該油藏中存在的微生物與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中α，β，γ-變形菌和芽孢桿菌的序列相似性最高。以序列

3、信息為指導(dǎo)，采用富集培養(yǎng)、直接培養(yǎng)和特殊培養(yǎng)的方法，從水樣中分離出5株高溫菌（而傳統(tǒng)分離方法只能獲得3株）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其中3株能在55℃以上兼性厭氧條件下生長(zhǎng)并降解原油，并使原油的粘度和凝固點(diǎn)顯著降低。
　　 利用多相分類技術(shù)，通過細(xì)菌的表型、生理生化指標(biāo)、碳源試驗(yàn)、細(xì)胞壁組成、16SrDNA和基因組DNA分子雜交等實(shí)驗(yàn)，確定菌株DM-1為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis DM-1，菌株DM-2為

4、嗜熱脂肪芽孢桿菌，命名為Geobacillus stearothermophilus DM-2。
　　 菌株DM-1在55℃高溫缺氧環(huán)境中，能以烴為唯一碳源乳化并降解原油。在LB固體培養(yǎng)基上，DM-1能產(chǎn)生粘性膿胞樣菌落，用產(chǎn)多糖培養(yǎng)基培養(yǎng)可產(chǎn)生胞外多糖使發(fā)酵液粘稠。該多糖物質(zhì)經(jīng)HPLC技術(shù)檢測(cè)，其主要成分為甘露糖（91.87％）、葡萄糖（7.95％）和半乳糖（0.18％）：對(duì)菌株DM-1產(chǎn)多糖的最佳碳源和發(fā)酵溫度進(jìn)行了選擇，發(fā)

5、現(xiàn)該菌株在45℃時(shí)利用蔗糖為碳源發(fā)酵，其多糖產(chǎn)量可達(dá)1.7g·L-1；利用非均質(zhì)巖心模擬的調(diào)剖實(shí)驗(yàn)表明，DM-1的菌體及其產(chǎn)生的胞外多糖在巖石表面形成生物膜對(duì)巖石孔隙起到了封堵作用，使注入壓力由0.01MPa增加到0.40MPa，滲透率降低了58.8％，采收率提高了3.9％，該菌株可用于微生物調(diào)剖。
　　 菌株DM-2在60℃～65℃高溫和缺氧條件下，能夠以烴為碳源生長(zhǎng)代謝，經(jīng)分析表明，DM-2對(duì)原油的降解率可達(dá)70％，且對(duì)原油

6、中各種正構(gòu)烷烴均有不同程度的降解，說明該菌株對(duì)原油有很強(qiáng)的降解能力。同時(shí)，菌株DM-2以糖為碳源可產(chǎn)生一種新型生物乳化劑，該乳化劑對(duì)柴油、苯、二甲苯、煤油和原油等均有很好的乳化效果，在常溫下形成EI-24值為100％的乳狀液。該乳化劑對(duì)酸堿穩(wěn)定，在pH1～pH14范圍內(nèi)對(duì)0＃柴油的乳化能力均為100％，經(jīng)高溫高壓作用后活性穩(wěn)定，且能耐受25％的高NaCl濃度。實(shí)驗(yàn)證明，該生物乳化劑由糖和蛋白組成，其中多糖含量約為38.6％，蛋白含量約為

7、55.7％。經(jīng)HPLC技術(shù)檢測(cè)，其多糖組分為甘露糖（37.8％）、葡萄糖（31.9％）、半乳糖（28.0％）和葡萄糖醛酸（2.3％），蛋白部分主要由賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸組成。菌株DM-2產(chǎn)生的乳化劑能夠提高烷烴和原油在水中的溶解度，形成水包油（o/w）乳狀液，對(duì)高含蠟原油的乳化、分散效果明顯，原油降解率達(dá)67.78％。礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明，DM-2菌株的發(fā)酵液乳化性能好，增油效果明顯，極具應(yīng)用前景。
　　 首次采用P

8、CR-DGGE技術(shù)對(duì)外源菌在油藏中的消長(zhǎng)情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，同時(shí)也得到了大量的內(nèi)源微生物信息。由于外源微生物的注入，遼河油田兩口井的原油產(chǎn)量均有明顯提高，井26-195的日產(chǎn)油量平均為1.58t，井27-221的日產(chǎn)油量平均可達(dá)4.52t，而實(shí)施微生物采油技術(shù)之前這兩口井的產(chǎn)油量幾乎為零。序列分析表明，在這兩口井中Proteobacteria是主要菌群，大多數(shù)是與烴降解相關(guān)的未培養(yǎng)微生物，這為功能性菌株的分離提供了信息。結(jié)合產(chǎn)油量曲線和DG

9、GE圖譜分析可知，采收率的提高與油藏內(nèi)源和外源微生物群落的存在密切相關(guān)。
　　 采用兼并引物擴(kuò)增了兩株高溫解烴菌的alkB片段，通過序列比對(duì)和氨基酸序列分析，驗(yàn)證了這兩段序列確實(shí)是alkB基因片段。對(duì)于烴降解微生物群落，alkB基因是編碼關(guān)鍵酶的功能基因，在種群的功能分析上具有重要作用。目前芽孢桿菌和地芽孢桿菌的烴降解基因研究還很少，給分析工作帶來很大困難，同時(shí)，如何將微生物種群與其生態(tài)功能聯(lián)系起來是目前微生物生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)難