濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞在重癥肌無力發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、重癥肌無力（Myasthenia gravis，MG）是由乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體介導(dǎo)的神經(jīng)肌肉接頭處獲得性自身免疫性疾病。目前普遍認(rèn)為：胸腺在MG的發(fā)生、發(fā)展以及疾病的維持中扮演著重要的角色。80％的MG患者合并有胸腺異常，包括胸腺增生和胸腺瘤，此外，H&E染色發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中有B細(xì)胞增生形成的異位生發(fā)中心（germinal centers，GCs）。濾泡輔助性T（T follicu

2、lar helper，Tfh）細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個重要亞群，在B細(xì)胞成熟、抗體產(chǎn)生、GC形成中發(fā)揮著極其重要的作用。研究表明 Tfh細(xì)胞及其相關(guān)的效應(yīng)分子在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為數(shù)量增加或者功能異常。有研究顯示 MG患者外周血中 Tfh細(xì)胞比例增加，但是 MG患者胸腺中是否也有 Tfh細(xì)胞比例的變化以及 Tfh對胸腺B細(xì)胞的輔助及異位GC形成中的作用目前尚不清楚。因此，我們的目的是通過研究MG患者外周血和胸腺中

3、的Tfh細(xì)胞比例的變化，及其與抗AChR抗體水平之間的關(guān)系，以及Tfh和B細(xì)胞之間的相互作用，探索Tfh細(xì)胞在抗體產(chǎn)生、異位GC形成及MG發(fā)病中的作用。
　　方法：
　　從唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集113例MG患者的外周血，其中眼肌型MG（Ocular MG，OMG）34例，全身型MG（Generalized MG，GMG）79例，同時收集20例年齡、性別相匹配的健康對照者（Healthy controls，HC）和9例單純的胸腺

4、瘤不合并MG（Non-MG-associated thymomas，NMG）患者為對照組。另外，我們還從唐都醫(yī)院胸外科收集28例合并胸腺異常的MG患者的胸腺組織以及外周血，其中OMG9例，GMG19例。同時還收集8例單純胸腺瘤患者的胸腺組織標(biāo)本以及從西京醫(yī)院心臟外科獲得9例正常胸腺作為對照組。分別采用密度梯度離心和機(jī)械分離的方法從外周血和新鮮的胸腺組織中分離獲得外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear

5、cells，PBMCs）和胸腺細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測 MG患者和對照組的外周血和胸腺組織中的Tfh和B細(xì)胞的比例；采用放免的方法檢測患者血清和胸腺組織上清中抗 AChR抗體的滴度，并且分析其與Tfh和B細(xì)胞的比例的相關(guān)性；通過RT-PCR的方法檢測PBMCs和胸腺組織中Tfh、Th1以及Th2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6、T-bet、以及GATA-3 mRNA的表達(dá)水平；分別采用了RT-PCR，Western Blotting以及EL

6、ISA的方法檢測了PBMCs和胸腺組織中Tfh、Th1以及Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-21、IFN-γ以及IL-4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步研究Tfh在AChR抗體產(chǎn)生及 MG病理過程中的作用，我們采用免疫磁珠分選的方法，從 GMG患者和健康對照者的PBMCs中分選純化Tfh和B細(xì)胞，單獨或者共同培養(yǎng)7天后，檢測培養(yǎng)上清中抗AChR抗體滴度和IL-21水平；同時我們還采用活細(xì)胞工作站的方法，動態(tài)觀察了Tfh和B細(xì)胞之間的相互作用

7、。此外，我們還通過免疫熒光染色、共聚焦熒光顯微鏡觀察MG患者胸腺組織中的異位GC以及Tfh與B細(xì)胞的共定位。另外，我還隨訪了28例胸腺切除后的MG患者，分析了他們術(shù)后疾病的轉(zhuǎn)歸情況，并且收集了3例術(shù)后復(fù)發(fā)的MG患者的骨髓，采用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測了骨髓中AChR特異性的長壽漿細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：
　　MG患者外周血及胸腺組織中CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）和B細(xì)胞的比例較對照組均顯著增高，并且GMG患

8、者顯著高于OMG患者，同時GMG患者血清以及胸腺組織上清中的抗AChR抗體滴度也顯著高于OMG和對照組，但是OMG和對照組之間比較無差異；相關(guān)性分析提示：Tfh細(xì)胞的比例與患者QMG評分和抗AChR抗體滴度水平均呈正相關(guān)；Tfh細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 Bcl-6和細(xì)胞因子 IL-21的表達(dá)在OMG和GMG患者的外周血以及胸腺中表達(dá)均顯著高于對照組，此趨勢在GMG患者組中更為明顯，但是Th1和Th2細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3和細(xì)

9、胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)在各組之間沒有差異；體外共培養(yǎng)的實驗中發(fā)現(xiàn)：GMG患者外周血的B細(xì)胞單獨、與自身的Tfh細(xì)胞或者與健康對照的Tfh細(xì)胞共同培養(yǎng)時，培養(yǎng)上清中均能檢測到抗AChR抗體，并且在GMG患者的B細(xì)胞與自身的Tfh細(xì)胞培養(yǎng)上清中AChR抗體滴度顯著高于其他組；同時，GMG患者Tfh細(xì)胞與自身的B細(xì)胞和GMG患者Tfh細(xì)胞與健康對照的B細(xì)胞培養(yǎng)的上清中有較高水平的IL-21，并且前者顯著高于后者；活細(xì)胞工作站也動態(tài)觀

10、察了Tfh和B細(xì)胞相互作用的過程；激光共聚焦結(jié)果提示：MG患者胸腺組織中存在異位 GC，并且異位 GC內(nèi)發(fā)現(xiàn)有CD4+CXCR5+Tfh的分布，同時觀察到Tfh與B細(xì)胞在空間上有相互接觸、相互作用的區(qū)域；對切除胸腺的MG患者隨訪結(jié)果顯示：MG患者在術(shù)后1個月時，外周血中Tfh、B細(xì)胞以及抗AChR抗體水平較術(shù)前降低，但是在疾病復(fù)發(fā)后又均升高，甚至超過術(shù)前的水平，并且發(fā)現(xiàn)胸腺切除術(shù)后復(fù)發(fā)的MG患者骨髓中存在AChR特異性長壽漿細(xì)胞，而健康

11、的對照者骨髓中幾乎沒有，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果提示：MG患者外周血以及胸腺中的 Tfh細(xì)胞可能參與了MG的病理過程。同時，MG患者胸腺中的Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用可能促進(jìn)了異位GC的形成和抗AChR抗體的產(chǎn)生，這可能是MG始動以及維持的主要原因。因此對Tfh細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控或特異性阻斷Tfh-B細(xì)胞的相互作用有可能成為MG治療的一個新靶點。此外，胸腺切除術(shù)后疾病復(fù)發(fā)的MG患者骨髓中檢測出AC