鈉尿肽嵌合體CNAAC的篩選及其抗慢性心力衰竭作用的研究.pdf

1、背景：
　　慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是因?yàn)樾募p傷（或病變）和心室長(zhǎng)期壓力或容量負(fù)荷過重，引起心肌收縮力受損，從而導(dǎo)致心室充盈（或）射血能力受損而引起的一組綜合征。心肌發(fā)生損傷后，交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（rennin angiotensin aldosterone system，RAAS）興奮，使多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活，促進(jìn)心肌重構(gòu)的發(fā)生，這進(jìn)一步加重了心肌損傷

2、并使心功能惡化，從而形成了惡性循環(huán)。盡管近年來對(duì)心力衰竭（heart failure，HF）發(fā)病機(jī)制和臨床防治的研究取得了較大進(jìn)展，但HF導(dǎo)致的死亡人數(shù)仍然逐年升高，成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。因此，對(duì)HF的研究亟待尋求新的突破，為推動(dòng)HF的防治提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　鈉尿肽（natriuretic peptides，NPs）家族的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了心臟內(nèi)分泌學(xué)的新領(lǐng)域，其在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理及病理生理學(xué)調(diào)節(jié)

3、作用。隨著研究的不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn) NPs不僅具有利鈉、利尿和舒血管作用，還具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生理和藥理學(xué)效應(yīng)。如今 NPs已成為 HF臨床診斷、預(yù)后和治療的明星分子。特別是針對(duì) NPs進(jìn)行不同改構(gòu)而獲得的新型鈉尿肽類藥物如心活素等已被臨床應(yīng)用于HF的治療，取得了滿意的效果。
　　NPs分子是由羧基端、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端三部分組成的多肽結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，心房鈉尿肽（atrial natriuretic pept

4、ide，ANP）的羧基端的5個(gè)氨基酸殘基在利尿方面起到重要作用，而環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能與受體結(jié)合及產(chǎn)生舒血管等作用有關(guān)。因此我們把ANP的羧基端進(jìn)行了保留，同時(shí)與天然NPs分子ANP、腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）和C-型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端進(jìn)行不同的組合，設(shè)計(jì)出所有可能結(jié)構(gòu)組合的7種新型NPs嵌合體，通過與ANP、CNP和VNP的舒血管

5、活性進(jìn)行比較，初步篩選出活性相對(duì)較強(qiáng)的4種NPs嵌合體：ANCAC、BNAAC、BNBAC、CNAAC。進(jìn)一步通過對(duì)4種NPs嵌合體分子的舒血管效應(yīng)進(jìn)行對(duì)比，篩選出活性最強(qiáng)的分子為 CNAAC并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)以觀察其在抗HF中的作用，具體研究?jī)?nèi)容為：以ANP、CNP和VNP作為對(duì)照，1.應(yīng)用離體血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)，研究CNAAC對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈的舒張作用及可能機(jī)制；2.采用整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察CNAAC對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)、尿量、尿cGMP及血c

6、GMP水平等指標(biāo)的影響；3.建立大鼠慢性缺血性HF模型，觀察CNAAC對(duì)HF大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能、相關(guān)體液因子和蛋白表達(dá)的影響。本研究旨在闡明新型 NPs嵌合體分子在抗 HF中的作用，為臨床應(yīng)用新型NPs嵌合體分子預(yù)防和治療HF提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　研究4種新型NPs嵌合體的舒血管作用，并篩選出活性最強(qiáng)的NPs嵌合體分子；探討活性最強(qiáng)的 NPs嵌合體的舒血管作用的可能機(jī)制；整體動(dòng)物研究其利尿和降壓作用以及在抗

7、HF中的作用。
　　方法：
　　1.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù)，對(duì)7種NPs嵌合體進(jìn)行初步篩選；觀察篩選出的4種NPs嵌合體分子對(duì)大鼠離體腹主動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用，篩選出活性最強(qiáng)的 NPs嵌合體。
　　2.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù)，檢測(cè)抗NPR-A抗體ab14356、非特異性鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclase，GC）抑制劑鎂藍(lán)（methylene blue，MB）、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guany

8、lyl cyclase，sGC）抑制劑 ODQ、cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）的抑制劑KT5823、NO合酶（nitric oxide sythase）抑制劑L-NAME（NG-Nitro-L-arginine methyl ester，hydrochloride）、ATP敏感性鉀離子通道（ATP-sensitive potassium channel，KATP）阻斷劑格列苯

9、脲（glybenclamide，Gly）、鈣依賴性鉀離子通道（Ca2+dependent potassium channel，KCa）阻斷劑四乙胺（tetraethylammonium chloride，TEA）對(duì)CNAAC舒血管作用的影響。
　　3.測(cè)定給予ANP、CNP、VNP或CNAAC孵育后，離體腹主動(dòng)脈在不同時(shí)間點(diǎn)分泌cGMP的水平，以探討NPs舒張血管作用與GC/cGMP信號(hào)通路的關(guān)系。
　　4.大鼠頸靜脈注射A

10、NP、CNP、VNP或CNAAC(50μg/kg)后記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，收集尿液和血液，檢測(cè)尿量及尿cGMP和血cGMP的水平。
　　5.采用三種不同的 HF造模方法：腹主動(dòng)脈狹窄法、冠脈結(jié)扎法以及（腹主動(dòng)脈狹窄+冠脈結(jié)扎）法，并通過觀察不同造模組大鼠的一般機(jī)體指標(biāo)、心臟/體重比（heart weight/body weight ratio，HW/BW）、血流動(dòng)力學(xué)、超聲心動(dòng)圖和病理學(xué)切片等指標(biāo)，以選取效果最好的方法進(jìn)行HF造模實(shí)

11、驗(yàn)。
　　6. HF造模當(dāng)天開始腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC（20 nmol/kg/2d），持續(xù)注射4周后進(jìn)行一般體征指標(biāo)觀察，對(duì)心臟、肺臟進(jìn)行稱重，記錄超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，觀察NPs對(duì)HF大鼠心臟功能的影響。
　　7.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù)，檢測(cè)CNAAC對(duì)HF大鼠離體腹主動(dòng)脈的舒張作用。8.蘇木素-伊紅（hematoxylin eosine，HE）染色法和Masson染色法（Masson’s tri

12、chrome stain）觀察心肌損傷和測(cè)定ANP、CNP、VNP和CNAAC對(duì)大鼠心肌梗死面積（infarct size，IS）和心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）的影響。
　　9. Elisa試劑盒檢測(cè)各組大鼠血清中BNP、AngII、ALD、ET-1、cGMP、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平的變化。
　　10.Western blotting檢測(cè)各組大

13、鼠左心室鈉尿肽受體A（natriuretic peptide receptor A，NPR-A）和鈉尿肽受體C（natriuretic peptide receptor C，NPR-C）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過初步篩選，從7種NPs嵌合體分子中得到了4種活性相對(duì)較強(qiáng)的NPs嵌合體：ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC，這4種嵌合體均可以劑量依賴性的舒張大鼠的腹主動(dòng)脈，其舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為：CNAA

14、C＞BNAAC＞ANCAC＞BNBAC；我們將CNAAC與ANP、CNP及VNP的舒血管作用進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)CNAAC具有優(yōu)于其他三種NPs的舒張效應(yīng)，舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為 CNAAC>VNP≥ANP>CNP，因此我們選取CNAAC作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)研究。
　　2. CNAAC可以劑量依賴性的舒張大鼠的離體腹主動(dòng)脈；CNAAC的舒張作用可被NPR-A抗體ab14356（1:1000）、GC的抑制劑MB（10-5 M）、sGC的

15、抑制劑ODQ（10-5 M）、KATP的阻斷劑Gly（10-6 M）、KCa的阻斷劑TEA（10-3 M）顯著減弱，被PKG抑制劑KT5823（10-5M）完全阻斷；而NO合酶抑制劑L-NAME（10-4M）對(duì)CNAAC引起的舒張作用沒有顯著影響，在去內(nèi)皮組和保留內(nèi)皮組其舒張作用沒有明顯差異。3.在不同的時(shí)間點(diǎn)，10-6 M的NPs均可以引起血管釋放cGMP。CNAAC在孵育血管5 min、15 min及30 min時(shí)引起的cGMP釋放

16、量均明顯高于ANP、CNP或VNP，且CNAAC引起的cGMP釋放具有時(shí)間依賴性。提前給予ODQ處理后，CNAAC引起的cGMP釋放量明顯減少。
　　4.靜脈注射ANP、VNP和CNAAC后，大鼠尿量均明顯增加，但靜脈注射CNP后，尿量未見明顯增加，利尿作用由強(qiáng)至弱為：CNAAC>ANP≥VNP>CNP；靜脈注射ANP、CNP、VNP和CNAAC后，大鼠的平均動(dòng)脈壓均明顯降低，其尿cGMP和血漿cGMP水平均明顯增加。
　　

17、5.整體實(shí)驗(yàn)中，選用缺血性 HF模型，各給藥組在大鼠冠脈結(jié)扎當(dāng)天開始給予腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC（20nmol/kg/2d,4 weeks）。CNAAC仍然可以劑量依賴性的舒張HF大鼠的離體腹主動(dòng)脈，且與內(nèi)皮無關(guān)。
　　6.與對(duì)照組相比，HF組大鼠精神萎靡，毛色暗黃，活動(dòng)度、飲食飲水減少，HW/BW、肺臟/體重比（pulmonary weight/body weight ratio，PW/BW）增高；與HF組相比

18、，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可改善大鼠的一般體征指標(biāo)、明顯降低大鼠的HW/BW，僅VNP和CNAAC可顯著降低大鼠的PW/BW；血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，HF組大鼠LVSP和±dp/dtmax明顯下降、LVEDP明顯上升；與HF組相比，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯改善大鼠的LVSP、LVEDP和±dp/dtmax；超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示：與對(duì)照組相比，HF組大鼠左室前壁搏動(dòng)幅度變?nèi)?，室腔擴(kuò)大；與HF組相比

19、，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯改善大鼠的EF、FS、LVEDV和LVESV，但只有CNAAC可明顯改善大鼠的LVEDD和LVESD，且CNAAC對(duì)LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV的改善作用明顯優(yōu)于ANP、CNP或VNP。
　　7．HE染色顯示：對(duì)照組心肌排列整齊，心肌橫紋清楚，未見明顯心肌梗死；HF組和各給藥組呈現(xiàn)顯著的心肌梗死，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，梗死區(qū)纖維化嚴(yán)重。Masson染色顯示：對(duì)照組心室腔、室

20、間隔正常；HF組和各給藥組左室壁變薄、蒼白，室間隔增厚，出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維。與HF組相比，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯減少心肌IS和CVF；其中CNAAC和VNP對(duì)IS的改善作用明顯優(yōu)于ANP和CNP，而且CNAAC對(duì)CVF的改善作用明顯優(yōu)于其他各組。
　　8.與對(duì)照組相比，HF組大鼠血清中BNP、AngII、ALD和ET-1的水平均明顯增高；與HF組相比，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯降低大鼠血清中A

21、ngII和ET-1的水平；但僅有VNP和CNAAC可明顯降低大鼠血清中的BNP水平，僅有ANP、VNP和CNAAC可顯著降低大鼠血清中 ALD的水平。與對(duì)照組相比，HF組大鼠血清中cGMP的水平明顯降低，ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯增高大鼠血清中cGMP的水平。
　　9.與對(duì)照組相比，HF組大鼠血清中炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的水平均明顯升高；與HF組相比，ANP、CNP和CNAAC可明顯降低

22、大鼠血清IL-1α的水平；ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯降低大鼠血清IL-6的水平；僅CNAAC可明顯降低大鼠血清IL-8和TNF-α的水平，CNAAC對(duì)大鼠血清IL-8和TNF-α的水平的降低作用優(yōu)于其他三種NPs；血清IL-10水平在各組之間沒有顯著性變化。
　　10.與對(duì)照組相比，HF組大鼠心臟的NPR-A表達(dá)量明顯減少；與HF組相比，ANP、VNP和CNAAC可明顯增加NPR-A的表達(dá)量，相互間沒有明顯差異，但

23、CNP對(duì)NPR-A表達(dá)量的影響遠(yuǎn)低于ANP。與對(duì)照組相比，HF組大鼠心臟的NPR-C表達(dá)量明顯增加；與HF組相比，ANP、CNP、VNP和CNAAC均明顯降低NPR-C的表達(dá)量。相互間沒有明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.本研究將 ANP羧基端與不同天然 NPs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)并合成了具有生物活性的7種NPs嵌合體分子，經(jīng)過篩選獲得了ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC等4種NPs嵌合體分子均具有劑量

24、依賴性的舒張血管作用，其舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為：CNAAC＞BNAAC＞ANCAC＞BNBAC；其中CNAAC可以劑量依賴性、非內(nèi)皮依賴的舒張大鼠的腹主動(dòng)脈，其舒張作用可能與NPR-A/sGC/PKG通路有關(guān)，KATP和KCa可能是CNAAC舒張作用的重要效應(yīng)分子。
　　2.靜脈注射CNAAC具有顯著的利尿和降壓作用，cGMP可能參與了其上述過程。
　　3.腹腔注射CNAAC可以顯著改善HF大鼠的左室收縮和舒張功能，減輕HF