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文檔簡介
1、繁縷(Stellaria media(L.)Villar.)為石竹科(Caryophyllaceae)繁縷屬(Stellaria L.)一年或二年生草本植物。繁縷分布于全國各省區(qū),為歐、亞廣布種,常生于水邊,溝邊及湖洲岸緣或土埂旁草叢中,野生資源十分豐富,具有開發(fā)利用潛質(zhì)。繁縷歸肝、大腸經(jīng),味微苦、甘、酸,性涼;以全草入藥,富含多糖、黃酮、環(huán)肽、酚酸等多種化學(xué)成分,具有明顯的抗炎和抗病毒作用。近年來,繁縷抗病毒的研究成為科研領(lǐng)域的熱點(diǎn),
2、本課題研究在中藥“組分結(jié)構(gòu)”理論的指導(dǎo)下,以HepG2.2.15細(xì)胞為藥效模型,篩選繁縷體外抗.乙肝病毒的活性部位;采用現(xiàn)代分離純化技術(shù),對繁縷中有效組分及成分進(jìn)行分析,并結(jié)合藥理試驗(yàn),進(jìn)一步解析繁縷抗乙肝病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。
本文首先對抗乙型肝炎病毒的天然產(chǎn)物研究概況作己概述,通過查閱文獻(xiàn),總結(jié)了繁縷屬化學(xué)成分與抗病毒的相關(guān)性,在此基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)部分主要進(jìn)行了以下研究:
1.繁縷抗乙肝病毒活性部位的篩選
采用鮮
3、藥繁縷榨汁,由鮮榨汁液制備7種不同方式處理的樣品,以HepG2.2.15細(xì)胞為乙肝病毒體外細(xì)胞模型,HBsAg、HBeAg和HBV DNA為檢測指標(biāo),篩選繁縷抗乙肝病毒的活性部位,結(jié)果表明繁縷大于5K部位具有較佳的抗乙肝病毒的效果。采用定性的方法進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試,可知繁縷大于5K部位含有多糖、蛋白和黃酮組分,為下一步詳細(xì)分析其抗乙肝病毒物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。
2.繁縷抗乙肝病毒組分間結(jié)構(gòu)分析
有效組分群是指多種有效
4、組分的組合,多組分共同作用可達(dá)到最佳的藥效結(jié)果。有效組分群的研究,即解析繁縷抗乙肝病毒組分間的結(jié)構(gòu)關(guān)系,實(shí)驗(yàn)以繁縷大于5K部位為研究對象,對其所含有的有效組分進(jìn)行研究。采用紫外分光光度法對繁縷大于5K部位的總黃酮、總糖和蛋白的含量進(jìn)行測定,可知三者的含量比為1:11.9:16.7。
繁縷大于5K部位凍干粉溶解離心,上清液上樣HP20大孔吸附樹脂分為水部位和醇部位:水部位主要含有蛋白和糖類的大分子化合物,醇部位主要為多酚類的小分
5、子化合物。大孔樹脂的水部位和醇部位按同等生藥量混合(D),與繁縷大于5K部位(A)、大孔樹脂水部位(B)和醇部位(C)進(jìn)行抗乙肝病毒的藥效考察,首先,從抗原角度分析,A和D對HBsAg和HBeAg的抑制率均高于B和C,且兩者之間統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(p>0.05),其抑制率僅次于陽性藥3TC。其次,從HBV DNA角度分析,A、D和3TC的HBV DNA含量與正常組具有顯著性差異(p<0.05)。由此可知,繁縷大于5K部位是其抗乙肝病
6、毒的有效組分群,大孔樹脂不會吸附其有效成分,多糖、蛋白等大分子物質(zhì)與黃酮等小分子化合物共同作用可發(fā)揮最佳的抗乙肝病毒的作用(以大分子物質(zhì)占主導(dǎo)作用),符合“組分結(jié)構(gòu)”理論的思想,繁縷抗乙肝病毒是多組分共同作用的結(jié)果。
3.繁縷抗乙肝病毒多糖組分和黃酮組分內(nèi)部結(jié)構(gòu)分析
(1)經(jīng)脫色、脫蛋白、DEAE-52和Sephadex G100處理,對多糖組分進(jìn)行分離純化,得到5種純度較高的均一化多糖(SMP-1~SMP-5),并
7、進(jìn)行了初級結(jié)構(gòu)解析。
首先,運(yùn)用高效凝膠滲透色譜測定5種繁縷多糖的分子量及其分布,5種繁縷多糖分子量分布在9000~25000之間,分子量分布系數(shù)均小于2,說明5種繁縷多糖皆為均一性多糖;多糖的含量測定表明,5種繁縷多糖中除SMP-1的含量較低(26%),其他四種繁縷多糖的多糖含量均在48%以上。
其次,多糖中單糖組成是多糖結(jié)構(gòu)解析中重要的一步。5種繁縷多糖經(jīng)三氟乙酸水解,乙?;螅捎肎C法分析其單糖組成及摩爾比,
8、可知SMP-1~SMP-3均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成,其摩爾比分別為鼠李糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=(2.44:3.70:1.00:9.78:3.70:11.56),(4.74:4.88:1.00:18.60:9.42:25.51),(10.61:8.10:3.19:1.00:15.55:22.21);SMP-4和SMP-5則均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成,其摩爾比分別為鼠李
9、糖:阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=(1.73:1.00:1.59:3.71:3.00),(5.41:26.30:2.06:1.00:36.73)。
最后,結(jié)合體外細(xì)胞模型,分析純化多糖及5種繁縷多糖按同等生藥量混合的組合物的抗乙肝病毒效果,5種繁縷多糖對HBsAg和HBeAg抑制率均較低(10%),繁縷組合物對乙肝病毒具有一定的抑制作用,200μg/mL濃度下在第9 d對乙肝病毒HBsAg和HBeAg抑制率分別達(dá)到26.5
10、6%和30.25%,與陽性藥3TC相比無顯著性差異(p>0.05)。
(2)繁縷大于5K部位含有黃酮類成分(黃酮組分),由高效液相色譜進(jìn)行化學(xué)成分表征可知,主要為黃酮碳苷類化合物,且繁縷大于5K部位經(jīng)大孔樹脂分離富集,各部位液相圖譜表明其所含化學(xué)成分相似,證實(shí)該部位小分子化合物主要為黃酮碳苷。采用LC-MS對繁縷大于5K部位中的黃酮成分進(jìn)行定性分析,由分析結(jié)果可知,該部位含有兩類黃酮碳苷成分,一類是分子離子峰[M+1]為594
11、,是以芹菜素為母核,連接兩個六碳糖的黃酮碳苷類;一個是分子離子峰[M+1]為564,是以芹菜素為母核,連接一個五碳糖和一個六碳糖的黃酮碳苷類。通過LC-MS的一級和二級質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)繁縷大于5K部位含有牡荊素,其裂解規(guī)律與文獻(xiàn)報道相符。
綜上所述,繁縷具有一定的抗乙肝病毒的作用,該工作至今未見報道。繁縷大于5K部位是其抗乙肝病毒的有效組分群,該組分群是由多糖組分、黃酮組分和蛋白組分共同組成。其中多糖組分中首次分離純化得到5種繁
12、縷精制多糖,分子量分布在9000~25000之間的均一性多糖,5種繁縷多糖按一定的比例混合均勻獲得繁縷多糖組合物,該組合物具有明顯的抗乙肝病毒活性,目前未見相關(guān)報道;黃酮組分對乙肝病毒的抑制作用較弱,本課題借助HPLC和LC-MS對繁縷大于5K部位的黃酮成分進(jìn)行了定性分析,由此對繁縷中的黃酮成分有了進(jìn)一步的認(rèn)識;由于時間問題,蛋白組分沒有進(jìn)行深入的分析研究,其是否影響繁縷抗乙肝病毒的活性還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證實(shí)。
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