異丙酚通過HNF-1α-apoM途徑抑制炎癥反應(yīng)的機制研究.pdf

1、異丙酚是一種廣泛應(yīng)用于臨床麻醉誘導和維持以及重癥患者鎮(zhèn)靜的靜脈麻醉藥。一系列的研究表明異丙酚具有抗炎抗氧化的特性:可以減少促炎因子的生成包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）以及活性氧簇的產(chǎn)生，減少氧自由基的形成，減低脂質(zhì)的過氧化和抑制血小板的聚集等。然而異丙酚的具體的抗炎機制仍然不是很明確。
　　 高密度脂蛋白具有心血管保護效應(yīng)，包括促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，抗炎和抗氧化特性等。載脂蛋白M

2、（ApolipoproteinM，apoM）是最近發(fā)現(xiàn)的與高密度脂蛋白密切相關(guān)的脂蛋白家族成員。研究表明apoM是一種負向快速反應(yīng)蛋白能夠發(fā)揮減少感染和炎癥反應(yīng)的作用。外界刺激誘發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生時，能夠減少肝臟和腎臟的apoM的mRNA水平和血清中apoM的分泌，同時也能引起Hep3B細胞apoM的分泌減少。此外，在人類，急性細菌感染或者慢性HIV感染后，血清中的apoM表達水平均降低。
　　 研究表明apoM表達受多種因素調(diào)控，

3、其中包括轉(zhuǎn)錄因子肝細胞核因子1α(Hepatocyte Nuclear Factor1α，HNF-1α)。研究表明，HNF-1α有一個穩(wěn)定的apoM結(jié)合位點，可與apoM增強子區(qū)域相結(jié)合，這對于肝臟和腎臟的apoM表達是必須的;HNF-1α缺乏的大鼠組織器官和血漿中均檢測不到apoM的mRNA表達;肝臟HNF-1α缺陷的大鼠血漿中的apoM表達濃度僅僅是野生型大鼠的一半;早發(fā)糖尿病患者由于HNF-1α基因突變血漿中的apoM表達也顯著降

4、低。此外研究表明HNF-1α的表達和功能也受到促炎因子的調(diào)節(jié):細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理后HNF-1α的mRNA水平和蛋白水平以及結(jié)合活性都顯著下調(diào)。
　　 然而，異丙酚是否能影響HNF-1α和apoM的表達還不清楚，HNF-1α和apoM是否可以介導異丙酚抑制LPS誘導的炎癥反應(yīng)還不是很清楚。本研究通過細胞實驗和動物實驗，觀察異丙酚對炎癥反應(yīng)，以及對HNF-1α和apoM的表達的影響并探討其

5、相關(guān)機制。
　　 目的：
　　 1、觀察異丙酚對脂多糖誘導處理的C57BL/6小鼠肝臟組織中apoM和HNF-1α表達的影響。
　　 2、觀察異丙酚對脂多糖誘導處理的HepG2細胞中的apoM和HNF-1α表達的影響。
　　 3、觀察HNF-1α是否參與異丙酚調(diào)節(jié)脂多糖誘導處理的HepG2細胞中apoM的表達。
　　 4、觀察異丙酚對脂多糖誘導處理的THP-1細胞的炎癥反應(yīng)的影響。
　　

6、5、觀察apoM是否參與異丙酚抑制脂多糖誘導處理的THP-1細胞的炎癥反應(yīng)。
　　 材料和方法：
　　 1、材料
　　 1.1藥品
　　 異丙酚（2，6-二異丙基苯酚）和細菌脂多糖（from Escherichia coli055:B5）均購買自Sigma公司（美國）。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(The PrimeScript RT Reagent kit，DRR037A)和實時熒光定量PCR試劑盒(the SY

7、BR(@) Premix Ex TaqTM(Ⅱ) kit，DRR820A)均購自于TaKaRa公司（日本）。
　　 其他化學試劑均為醫(yī)藥級別，均來自于試劑供應(yīng)商。
　　 1.2動物
　　 選取8周齡，雌性C57BL/6小鼠80只，均購買于北京大學實驗動物中心，平均體重為20克。隨機分為四組每組20只(1)對照組（control組）-腹腔注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4);(2)細菌脂多糖組（LPS組）-腹腔

8、注射5mg/kg細菌脂多糖;(3)異丙酚組（Prop組）-腹腔注射10mg/kg異丙酚;(4)細菌脂多糖+異丙酚組(LPS+Prop)-腹腔注射5mg/kg細菌脂多糖和10mg/kg異丙酚。所有的動物每五只放在同一籠飼養(yǎng)，室溫維持在25℃，采用12h晝夜循環(huán)。實驗動物購買，飼養(yǎng)以及動物實驗程序均得到南方醫(yī)院實驗動物中心批準。
　　 1.3細胞培養(yǎng)
　　 人肝癌組織細胞(HepG2)和人急性單核白血病細胞(THP-1)均購

9、買于American Type Culture Collection（美國弗吉尼亞州，馬納薩斯）。HepG2細胞生長于37℃，5％ CO2，含有10％新生胎牛血清的DMED培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。THP-1細胞生長于37℃，5％ CO2，含有10％新生胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，在每次實驗前用100nM佛波酯(phorbol12-myristate13-

10、acetate，PMA)5％CO2，37℃孵育THP-1細胞72h，誘導使其分化成巨噬細胞，細胞貼壁分別接種到6孔板、12孔板或者60毫米培養(yǎng)皿中，等到細胞生長到匯合度為80-90％時進行處理。在實驗前用PBS清洗兩次，最后一次用不含抗體的無血清的PBS沖洗。
　　 2、方法
　　 2.1 RNA分離提取和實時定量PCR(real-time PCR)
　　 根據(jù)Invitrogen公司RNA提取試劑盒操作說明提取

11、小鼠組織或培養(yǎng)細胞中的總RNA。然后將1μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成20μl的cDNA。實時熒光定量PCR在應(yīng)用生物系統(tǒng)ABI7500FAST上進行。溶解曲線分析表明PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨的雙鏈DNA。采用ΔΔCt值法，以GAPDH表達為內(nèi)參定量其它基因的表達。
　　 2.2 Western blot分析
　　 根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明書提取小鼠組織和培養(yǎng)細胞的總蛋白，采用BCA法蛋白定量試劑盒(Ke

12、yGen Biotechnologies，中國南京)進行蛋白定量。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每個點樣孔30μg總蛋白。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜后，孵育一抗。采用兔抗apoM多克隆抗體(BD Biosciences，San Jose，CA，美國)，兔抗iNOS多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.Santa Cruz，CA，美國)，兔抗HNF-1α多克隆抗體和兔抗β-actin-單克隆抗體(Abcam，Ca

13、mbridge，MA，美國)。孵育結(jié)束后以HRP-兔抗山羊IgG二抗進行孵育，再采用化學熒光蛋白顯色方法(ECL Plus Western Blot Detection System;Amerisham Biosciences, Foster City,CA，美國)進行顯色曝光。
　　 2.3細胞因子檢測
　　 采用100 nmol/L氟波脂(PMA)誘導孵育THP-1細胞72小時使其分化成巨噬細胞，分別經(jīng)細菌脂多糖，和

14、脂多糖聯(lián)合異丙酚處理。收集細胞上清分別采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Amersham Biosciences)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的表達情況。
　　 2.4小分子干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染
　　 特異性siRNA-HNF-1α和siRNA-apoM的RNA干擾片段以及長度為21個核苷酸的siRNA陰性對照片段均購自廣州銳博生物科技有限公司。采用脂質(zhì)體2

15、000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細胞(2×106/well)。轉(zhuǎn)染48小時后采用實時定量PCR和westem blot檢測目的基因mRNA和蛋白表達情況。
　　 2.5重組質(zhì)粒構(gòu)建
　　 包含HNF-1α的PCR-XL-TOPO載體和PIRES2-EGFP載體購自Invitrogen公司。在HNF-1α上游添加EcoRI酶切位點擴增得到EcoRI-HNF-1α片段;在EGFP下游添加XhoI酶切位點，在上游添加IR

16、ES連接基因，擴增得到IRES-EGFP-XhoI。進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，分別凝膠電泳回收EcoRI-HNF-1α和IRES-EGFP-XhoI目的條帶。通過重疊PCR將上述兩個片段進行連接，合成含有目的基因HNF-1α和EGFP的片段EcoRI-HNF-1α-IRES-EGFP-XhoI。重疊PCR反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳回收EcoRI-HNF-1α-IRES-EGFP-XhoI的目的條帶。雙酶切上述重疊PCR的回收產(chǎn)物與pCD

17、NA3.1(+)載體。并采用連接酶切回收的HNF-1α-IRES-EGFP片段和pcDNA3.1(+)載體。再將感受態(tài)大腸桿菌DH5α解凍后與含重組質(zhì)粒連接反應(yīng)液充分混合進行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。利用PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒，并用測序引物作測序鑒定。鑒定正確無誤后，利用超純質(zhì)粒試劑盒提取pcDNA3.1-HNF-1α以備使用。采用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1-HNF-1α轉(zhuǎn)染目的基因。
　　 結(jié)果：
　　 1、異丙酚對脂多

18、糖誘導處理的小鼠肝臟組織中apoM和HNF-1α表達的影響
　　 采用實時定量PCR檢測各組各時間點apoM和HNF-1α的mRNA表達，析因分析結(jié)果表明，對于apoM和HNF-1α的mRNA表達，不同處理組和各處理組不同處理時間之間存在交互效應(yīng)（F=141.603，P=0.000; F=118.214，P=0.000）。經(jīng)脂多糖處理后，6小時，12小時和24小時apoM的mRNA表達水平均顯著下調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義

19、(P=0.000; P=0.000; P=0.000);異丙酚處理后，6小時，12小時和24小時apoM的mRNA表達水平均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000; P=0.000; P=0.000）;經(jīng)脂多糖和異丙酚聯(lián)合處理后，6小時，12小時和24小時apoM的mRNA表達水平改變，與0小時比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000; P=1.000; P=0.732）。經(jīng)脂多糖處理后，6小時，12小時和24小時HNF-

20、1α的mRNA表達水平均顯著下調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000; P=0.000; P=0.000);異丙酚處理后，6小時，12小時和24小時HNF-1α的mRNA表達水平均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000;P=0.000; P=0.000);脂多糖和異丙酚聯(lián)合處理后，6小時，12小時和24小時HNF-1α的mRNA表達水平改變，與0小時比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000; P=1.000;P=

21、1.000）。而且脂多糖對apoM和HNF-1α的mRNA表達抑制作用在24小時最強(41.400±7.301 vs100.200±4.207, P=0.000;38.400±8.019 vs100.200±9.257,P=0.000);異丙酚對apoM和HNF-1α的mRNA表達增強作用也具有時間依賴性，隨著時間延長而增強，在24小時增加最明顯（256.400±8.355 vs99.200±8.438，P=0.000;288.800±

22、13.255 vs99.800±9.203，P=0.000）。采用western-blot檢測各處理因素處理24小時后，各組apoM和HNF-1α的蛋白表達:脂多糖處理后，apoM和HNF-1α的蛋白表達水平均顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000);異丙酚處理后，apoM和HNF-1α的蛋白表達水平則均顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000，P=0.000);脂多糖和異丙酚聯(lián)合處理后，a

23、poM和HNF-1α的蛋白表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.079，P=0.090）。
　　 2、異丙酚對HepG2細胞apoM和HNF-1α表達的影響
　　 由于apoM和HNF-1α在小鼠肝臟組織中的表達受脂多糖的負向調(diào)節(jié)，并且apoM的表達受HNF-1α的直接調(diào)節(jié)。我們通過實時定量PCR方法檢測脂多糖和異丙酚對HepG2細胞apoM和HNF-1α表達的影響:脂多糖誘導處理后，apoM的mRNA表

24、達在6h，12h和24h均顯著下調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.048; P=0.002; P=0.000）;HNF-1α的mRNA表達在6h，12h和24h也均顯著下調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.019; P=0.000; P=0.000）;異丙酚處理后，apoM的mRNA表達在6h，12h和24h均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.016; P=0.000;P=0.000）;HNF-1α的mRNA

25、表達在6h，12h和24h也均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042;P=0.000;P=0.000)。然后我們采用western blot方法檢測脂多糖和異丙酚對HepG2細胞apoM和HNF-1α蛋白表達的影響:脂多糖處理后，apoM的蛋白表達水平在6h，12h和24h均顯著下調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043;P=0.001;P=0.000); HNF-1α的蛋白表達水平在6h，12h和24h均顯著下

26、調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.030; P=0.000; P=0.000）。相反，當異丙酚處理后，apoM的蛋白表達水平在6h，12h和24h均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004; P=0.000; P=0.000）;HNF-1α的蛋白表達水平在6h，12h和24h也均顯著上調(diào)，與0小時比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000; P=0.000; P=0.000）。
　　 3、異丙酚通過HNF-1α途

27、徑調(diào)節(jié)HepG2細胞的apoM表達
　　 首先采用HNF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞，使轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞的HNF-1α表達降低。Western blot結(jié)果顯示與對照組比較，siRNA組HNF-1α的表達下降達到89％（0.113±0.060 vs1.003±0.096），差異有統(tǒng)計學意義（F=115.062，P=0.000）。然后檢測異丙酚對HNF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染后的HepG2細胞apoM蛋白表達的影響:實

28、驗分組如下:對照組:0μM異丙酚+0ng/ml脂多糖，LPS組:10ng/ml脂多糖，Prop組:50μM異丙酚，LPS+Prop組:50μM異丙酚+10ng/ml脂多糖。在經(jīng)過negativecontrol處理的HepG2細胞中，LPS組apoM蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006); Prop組apoM蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);LPS+Prop組apoM蛋白表

29、達水平與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000）。在HNF-1α的表達被HNF-1α-siRNA干擾后，LPS組apoM蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005）;Prop組apoM蛋白表達水平改變與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.623);LPS+Prop組apoM蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012）。接下來，我們采用HNF-1α重組過表達質(zhì)粒使HNF-1α表達增加

30、，觀察異丙酚對于HepG2細胞apoM蛋白表達的影響。用重組過表達質(zhì)粒上調(diào)HNF-1α的表達可以達到613％（6.137±0.172 vs1.007±0.131），與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=1337.813，P=0.000）。重組過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細胞，實驗分組如下:對照組:0μM異丙酚+0ng/ml脂多糖，LPS組:10ng/ml脂多糖，Prop組:50μM異丙酚，LPS+Prop組:50μM異丙酚+10ng/ml脂多

31、糖。Prop組apoM的表達被顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）;LPS+Prop組apoM的表達被顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000); LPS組的apoM的表達水平變化，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P=1.000)。
　　 4、異丙酚抑制THP-1巨噬細胞的炎癥反應(yīng)
　　 將THP-1巨噬細胞隨機分為四組:Control組:0μM異丙酚+0ng/mlLPS，LPS組:10

32、 ng/mlLPS，Prop組:50μM異丙酚，LPS+Prop組:50μM異丙酚+10ng/mlLPS分別孵育24小時。結(jié)果，LPS組apoM的蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003）;Prop組apoM的蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000); LPS+Prop組apoM的表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000）。同樣，脂多糖誘導處理后，LPS組HNF-

33、1α的蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012）;Prop組HNF-1α蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);LPS+Prop組HNF-1α的蛋白表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=0.555）。接下來用western blot方法檢測了iNOS蛋白表達水平，結(jié)果:LPS組iNOS的蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);Prop組iN

34、OS的蛋白表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000）;LPS+Prop組iNOS的蛋白表達水平顯著上調(diào)，與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。之后我們采用ELISA方法檢測THP-1巨噬細胞中炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達變化。實驗分組如下，Control組:0μM異丙+0ng/mlLPS，LPS組:10ng/mlLPS，Prop組:50μM異丙酚，LPS+Prop組:50μM異丙酚+10

35、ng/mlLPS，分別孵育24小時。ELISA結(jié)果:LPS組TNF-α，IL-1β和IL-6的表達水平顯著增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P=0.000，P=0.000）;Prop組TNF-α，L-1β和IL-6的表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000，P=1.000，P=1.000）;LPS+Prop組的TNF-α，IL-1β和IL-6的表達水平顯著下降，與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0

36、.000，P=0.000，P=0.000)。
　　 5、異丙酚通過apoM途徑抑制THP-1巨噬細胞的炎癥反應(yīng)
　　 采用apoM-siRNA轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細胞，經(jīng)過apoM-siRNA處理的THP-1巨噬細胞apoM的蛋白表達下降了86％（0.140±0.076 vs1.003±0.086），與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=97.836，P=0.000）。實驗分組如下，處理因素:Control組:0μM異丙酚+0

37、ng/ml脂多糖，LPS組:10ng/m脂多糖，Prop組:50μM異丙酚，LPS+Prop組:50μM異丙酚+10ng/ml脂多糖，分別孵育24小時。首先檢測iNOS的蛋白表達:negative control處理條件下，THP-1巨噬細胞中，LPS組iNOS蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）;Prop組iNOS蛋白表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000）;LPS+Prop組iN

38、OS的蛋白表達水平顯著下調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。在apoM-siRNA轉(zhuǎn)染的THP-1巨噬細胞，LPS組iNOS蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），Prop組iNOS蛋白表達水平改變，與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義（P=1.000）;LPS+Prop組iNOS蛋白表達水平顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）

39、，與LPS組比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.843)。接下來將被apoM-siRNA和negative control轉(zhuǎn)染的THP-1巨噬細胞隨機分為五組(1)Control組，(2)siRNA-NC+異丙酚(50μM)組，(3)siRNA-apoM+異丙酚(50μM)組，(4) siRNA-NC+異丙酚(50μM)+脂多糖(10ng/ml)組，(5)siRNA-apoM+異丙酚(50μM)+脂多糖(10ng/ml)組，五組細胞分別在3

40、7℃孵育24小時。采用ELISA方法分析各組炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達情況。異丙酚與脂多糖聯(lián)合處理用apoM-siRNA轉(zhuǎn)染的THP-1巨噬細胞后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達均被升高，與siRNA-NC+異丙酚+脂多糖組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P=0.000，P=0.000）。
　　 結(jié)論：
　　 1、異丙酚可以上調(diào)C57BL/6小鼠肝臟組織中的apoM和HNF-1α的mRN