線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、背景：
　　大腸癌（Colorectal Cancer,CRC）包括結(jié)腸癌和直腸癌，是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，全球每年新增約100萬(wàn)大腸癌患者，死亡51萬(wàn)例，為第三號(hào)癌癥殺手。過(guò)去10年里，在大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較低的地區(qū)，其發(fā)病率快速上升。全國(guó)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)大腸癌死亡率也處于顯著上升態(tài)勢(shì)。
　　大腸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，是環(huán)境致癌因素和遺傳易感因素共同作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌預(yù)后與

2、早期診斷密切相關(guān)。截止目前，已經(jīng)證明用結(jié)腸鏡和乙狀結(jié)腸鏡進(jìn)行早期篩查和診斷可有效降低大腸癌的發(fā)病率和死亡率。然而，盡管這些方法有相對(duì)高的敏感性和特異性，但它們是一種侵入式檢查方法而且價(jià)格很貴，不適于大眾普查。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，近幾年來(lái)我國(guó)在大腸癌的基礎(chǔ)、臨床和預(yù)防方面的研究取得了較大的進(jìn)展，但迄今為止對(duì)其發(fā)病、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制的了解仍然十分缺乏。對(duì)高危人群(年齡在40以上、有大腸癌家族史或腸息肉患者)進(jìn)行普查能早期發(fā)

3、現(xiàn)大腸癌，但當(dāng)大腸癌病變較小時(shí)，臨床無(wú)明顯表現(xiàn)，癌胚抗原（Carcinoma embryonic antigen,CEA）等腫瘤標(biāo)志物特異性又不高，結(jié)腸鏡檢查目前尚未完全普及，所以目前大腸癌的早期診斷還缺乏簡(jiǎn)易有效的手段。因此，尋找一種新的簡(jiǎn)便易行的可應(yīng)用于大腸癌篩查、診斷、判斷預(yù)后、治療監(jiān)測(cè)的腫瘤標(biāo)志物就顯得十分重要。鑒于線粒體在能量代謝、氧自由基生成和細(xì)胞凋亡中的特殊地位，特別是線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mt

4、DNA）測(cè)序的完成，人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤的生物學(xué)特征不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，而且與核外的線粒體DNA的變異有著非常重要的關(guān)系。
　　人類每個(gè)細(xì)胞包含102～104個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體DNA約有2～10個(gè)基因拷貝，線粒體DNA含16569個(gè)堿基對(duì)（Base pair,bp），為一環(huán)狀雙鏈DNA分子。線粒體DNA無(wú)內(nèi)含子，與核基因不同，線粒體DNA缺乏組蛋白的保護(hù)和有效的修復(fù)機(jī)制，它更易于受到活性氧族（Reactive Oxygen S

5、pecies,ROS）及其他基因毒性的損害，成為致癌作用的靶點(diǎn)。這使得線粒體DNA具有不同于核DNA的顯著特點(diǎn)，包括高拷貝數(shù)、高突變率、高度多態(tài)性、嚴(yán)格的母系遺傳等。線粒體DNA的突變及拷貝數(shù)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而且線粒體DNA的異常具有顯著的腫瘤特異性。目前已在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變及拷貝數(shù)的變化，并在腫瘤病人的白細(xì)胞中也檢測(cè)到這種突變，但其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具體的生物學(xué)意義尚不清楚。本課題研究的目的在于發(fā)

6、現(xiàn)大腸癌患者外周血(peripheral blood lymphocytes,PBLs)中mtDNA拷貝數(shù)變異的特征與規(guī)律以及mtDNA拷貝數(shù)在大腸癌患者外周血和大腸正常組織中的相關(guān)性，以探討可否用外周血代替組織來(lái)研究mtDNA拷貝數(shù)變異與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系，并有望為將來(lái)大腸癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估提供新的簡(jiǎn)易有效的標(biāo)志物，以期能早期發(fā)現(xiàn)大腸癌，提高大腸癌患者的生存期。
　　方法：
　　1．采用病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方

7、法，納入320例來(lái)自西安第四軍醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院的年齡為22-87歲的原發(fā)大腸癌患者和320例22-88歲健康人作為對(duì)照。所有入選病例組的患者均為首次確診為大腸癌，所有入組研究對(duì)象均未進(jìn)行過(guò)放化療。病例組的納入沒(méi)有嚴(yán)格的年齡、性別和疾病分期的限制。320例健康對(duì)照是來(lái)自在同一時(shí)期到唐都醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人，沒(méi)有腫瘤史（良性黑色素瘤除外）。對(duì)照組與病例組在性別、年齡（±3歲）、居住地上嚴(yán)格配對(duì)。所有研究對(duì)象均為漢族。
　　2．采

8、集320例大腸癌患者和320例健康對(duì)照的外周血，并從病例組中隨機(jī)收集10例大腸癌患者的正常大腸組織，用OmegaBlood﹠TissueDNA提取試劑盒提取血液DNA及組織DNA，-40℃冰箱保存。
　　3．應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time Quantatitative Polymerase Chain Reaction，real-time QPCR）測(cè)定入選病例組及對(duì)照組研究對(duì)象外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)，并檢測(cè)10

9、對(duì)外周血及大腸組織（每對(duì)外周血和大腸組織均來(lái)自同一個(gè)體）中的線粒體DNA拷貝數(shù)。
　　4．在獲取知情同意書(shū)后，收集所有研究對(duì)象的年齡、性別、吸煙、飲酒、受教育程度、身體質(zhì)量指數(shù)（bodymassindex，BMI）、飲食情況、家族腫瘤史、環(huán)境暴露情況、體力活動(dòng)、使用非甾體抗炎藥（Non-steroidal anti-inflammatorydrugs，NSAIDs）及激素替代療法（Hormone replacement thera

10、py,HRT）情況以及病人的手術(shù)時(shí)間、腫瘤位置、腫瘤病理類型、病理分級(jí)、臨床分期、化療情況等臨床資料，并進(jìn)行術(shù)后治療、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡等情況的隨訪。
　　5．運(yùn)用SPSS16.0軟件包分析大腸癌患者外周血和大腸組織中線粒體DNA拷貝數(shù)的相關(guān)性、外周血線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后之間的關(guān)系。以優(yōu)勢(shì)比（odd sradio，OR）、危險(xiǎn)比（hazard radio，HR）和95％可信區(qū)間（confidence interv

11、al，CI）來(lái)估計(jì)mtDNA拷貝數(shù)與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后之間的相對(duì)危險(xiǎn)度。所有P值都是雙尾，P<0.05或95％可信區(qū)間（CI）不包括1.0認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．研究對(duì)象一般資料的分布特征病例組與健康對(duì)照組在性別（P=1.00）和年齡（58.42±13.12vs.58.16±13.53歲,P=0.807）上具有很好的匹配性，在飲酒（P=0.395）、受教育程度（P=0.169）、BMI（P=0.632）以及

12、非甾體抗炎藥的使用（P=0.477）上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，病例組中吸煙的人數(shù)和吸煙量均比健康對(duì)照組中的要多（39.37％vs.32.81％,P=0.084；26.2±14.94vs20.29±13.05包/年，P=0.002）。板子間和板子內(nèi)的平均變異系數(shù)分別為6.9％(3.9％-9.1％)和4.2％(2.4％-6.9％)。
　　2．線粒體DNA拷貝數(shù)的分布特征大腸癌患者外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)（median:1.03;range=0

13、.46-3.37）比健康對(duì)照外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)（median:0.86;range=0.48-3.06）要高，二者存在顯著性差異（P<0.001）。進(jìn)一步分層分析我們發(fā)現(xiàn)，在病例組和對(duì)照組中，性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)均沒(méi)有影響（P值范圍：0.151-0.909）。
　　3．外周血中及正常大腸組織中線粒體DNA拷貝數(shù)的相關(guān)性分析運(yùn)用Pearson相關(guān)分析對(duì)10對(duì)大腸癌患者外周血及大腸組織中線粒體DN

14、A拷貝數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸組織中線粒體DNA拷貝數(shù)具有很好的相關(guān)性(r=0.659,p=0.038)。
　　4．線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析運(yùn)用非條件logistic回歸分析線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，與線粒體DNA拷貝數(shù)低的相比，線粒體DNA拷貝數(shù)高的患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（adjusted OR=2.04,95％CI=1.48-2.82）。進(jìn)一

15、步進(jìn)行四分位法分析發(fā)現(xiàn)，大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)呈劑量依賴關(guān)系（P<0.001）。分層分析發(fā)現(xiàn)高的線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性不受其他因素的影響。
　　5．線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析隨訪了320例大腸癌患者，其中失訪37例，另有6例不符合入組標(biāo)準(zhǔn)，有277例手術(shù)的腺癌病人納入了預(yù)后分析。Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤位置、受教育程度對(duì)預(yù)后沒(méi)有明顯的影響（

16、adjusted HR：0.74-1.34）；臨床分期、腫瘤分級(jí)與預(yù)后明顯相關(guān)，臨床分期越高預(yù)后越差（以0/I期為參考，從Ⅱ期到Ⅳ期，adjustedHR分別為6.81、11.98、25.48），腫瘤病理分化越差患者預(yù)后越差（以高度分化為參考，中度分化及低度分化的adjusted HR分別為1.55、2.53）；與不化療的患者相比，術(shù)后實(shí)施輔助化療可明顯降低患者死亡風(fēng)險(xiǎn)（adjusted HR=0.57）；線粒體DNA拷貝數(shù)與大腸癌復(fù)發(fā)

17、（P=0.008）和死亡（P=0.007）顯著相關(guān)，外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)高的患者要比拷貝數(shù)低的患者預(yù)后差（復(fù)發(fā)和死亡的adjusted HR分別為1.87、2.01）。采用Kaplan Meier法進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA拷貝數(shù)高的患者與線粒體DNA拷貝數(shù)低的患者相比，其生存率明顯要差（Logran kP=0.002）。
　　結(jié)論：
　　1．大腸癌患者外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)與其大腸組織中線粒體DNA拷貝數(shù)有顯著相

18、關(guān)性。這就證明可以用外周血中的線粒體DNA拷貝數(shù)來(lái)代替腸組織中的線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)行其變異的檢測(cè)。
　　2．大腸癌患者外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)增高與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，高的線粒體DNA拷貝數(shù)具有高的大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，二者呈劑量依賴關(guān)系。
　　3．大腸癌患者外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)與其預(yù)后顯著相關(guān)，線粒體DNA拷貝數(shù)高的患者預(yù)后較差。從以上結(jié)論我們推測(cè)，外周血中線粒體DNA拷貝數(shù)可能會(huì)成為大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)后監(jiān)測(cè)的