復合神經(jīng)動作電位對損傷神經(jīng)的定量研究.pdf

1、第一部分、在體大鼠正中神經(jīng)復合神經(jīng)動作電位的記錄方法和電極間距選擇
　　 目的：本研究的目的是研究大鼠正中神經(jīng)復合神經(jīng)動作電位在體記錄的方法和電極距離參數(shù)。
　　 方法：用不同的方法在短的大鼠正中神經(jīng)干上記錄CNAP，觀察復合神經(jīng)動作電位的各參數(shù)變化，找出一種既可行又穩(wěn)定的CNAP記錄方法，然后順行或逆行記錄CNAP，比較這兩種記錄方法的差異，最后改變記錄CNAP的不同電極之間間距(三種距離)，包括在刺激電極兩針之間，記

2、錄電極兩針之間，記錄和刺激電極之間，分別從1mm、2mm、3mm、4mm、5mm，觀察刺激電極間距、記錄電極間距、刺激到記錄電極間距分別對CNAP的影響。
　　 結(jié)果：如果完全游離整個神經(jīng)干，刺激、記錄電極分別置于兩端，地線不管置于神經(jīng)干上、附近筋膜組織、還是無地線，均不能記錄到CNAP。但僅游離神經(jīng)干遠端和近段，中間約5mm左右的一段未游離，地線置于中間未游離組織系膜附近組織，就可以恒定地記錄到CNAP。逆向記錄的CNAP，為

3、三相波，雖刺激強度較小(包括閾刺激和超大刺激強度)，但基線不平，干擾大，不易于精確測量；順向記錄的CNAP，為雙相波，波形較穩(wěn)定，雖刺激強度較大(包括閾刺激和超大刺激強度)，但干擾小，易于精確測量。當刺激電極兩針之間的距離從1.0毫米到5.0毫米改變時，記錄到的CNAP的刺激閾值和超強刺激強度逐漸減低(P<0.01)。當記錄電極兩針之間的距離從1.0毫米到5.0毫米改變，記錄到的CNAP幅度逐漸增加(P<0.01)。當記錄和刺激位置之間

4、的距離(8毫米，10毫米，12毫米)改變時，記錄到的CNAP各參數(shù)沒有顯著變化(P>0.05)。
　　 結(jié)論：大鼠正中神經(jīng)上臂部，兩端游離，中間保留系膜，不游離，地線插入刺激與記錄之間的系膜附近，能恒定記錄到CNAP；刺激電極與記錄電極最佳間距均為5.0mm，刺激電極到記錄電極之間最佳距離為10mm；順向記錄的CNAP波形較為穩(wěn)定，干擾小，易于測量，優(yōu)于逆向記錄。
　　 第二部分、大鼠正中神經(jīng)再生不同時段電生理(CNAP

5、、CMAP)、功能、形態(tài)學、分子生物學特點及他們之間的相關(guān)性分析
　　 實驗一：大鼠正中神經(jīng)再生不同時段電生理(CNAP、CMAP)、功能、形態(tài)學特點及他們之間的相關(guān)性分析
　　 目的：探討大鼠正中神經(jīng)切斷吻合后的不同時段電生理(CNAP、CMAP)、功能與形態(tài)學方面的特點及他們之間的相關(guān)性分析。
　　 方法：大鼠上臂正中神經(jīng)中段切斷縫合后的不同的時間點(從2-12w)，進行抓握力測試，然后游離正中神經(jīng)進行CNA

6、P、CMAP檢測，最后切取正中神經(jīng)縫合口遠端、近端和正常側(cè)神經(jīng)組織分別標記固定進行電鏡半薄切片甲苯胺藍染色和超薄切片餓酸染色，分別行光鏡和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察，獲取有髓纖維計數(shù)、髓鞘厚度等各種形態(tài)學參數(shù)。獲取指淺屈肌標本，稱濕重后，甲醛固定，行肌肉HE染色，觀察形態(tài)學變化。對CNAP的波幅和有髓神經(jīng)纖維計數(shù)進行相關(guān)性分析；對CMAP的波幅和抓握力進行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：術(shù)后第2w，可以記錄到CNAP。術(shù)后2，3，4，6，8和1

7、2周，再生神經(jīng)記錄的CNAP幅度，峰-峰幅度(PPA)，與正常的CNAP相比，有顯著差異(P<0.01)。波幅下面積(Area)也顯著低于正常(P<0.01)。2周到6周的潛伏期(Lat)均比正常明顯延長(P<0.05)。傳導速度(CV)顯著慢于正常對照(P<0.01)。2周到8周刺激強度(閾強度THI和超大刺激強度SSI)顯著低于正常對照。術(shù)后第2、3w記錄的CNAP波幅比術(shù)后第6、8、12w明顯降低。術(shù)后第6w后，CNAP波幅開始傾

8、向于穩(wěn)定，CNAP波幅恢復率也接近第8w和12w。術(shù)后2周，實驗側(cè)僅有1只大鼠，記錄到CMAP小于0.5mV的波幅(Amp)和大于12ms的潛伏期(Lat)，其余5只均未記錄到CMAP。術(shù)后2-8周：實驗側(cè)的CMAP的波幅和波形下面積(Area)比對照側(cè)顯著減少(P<0.01)；損傷神經(jīng)的前肢抓握力：術(shù)后2周，均為0g；術(shù)后3周，除一個樣本(12±4g)，其余均為0g。再生神經(jīng)前肢抓握力的恢復率統(tǒng)計分析。術(shù)后第2，3，4和6周，再生神經(jīng)

9、的前肢抓握力與健側(cè)有顯著差異(P<0.01)。神經(jīng)修復后2w吻合口遠端已有少量的新生軸突，隨著再生時間延長，越來越多的再生軸突延伸至遠端。正常正中神經(jīng)的CNAP波幅和有髓纖維的計數(shù)的線性回歸分析，CNAP波幅和有髓纖維的計數(shù)之間有強的正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)0.98。而對于不同時段再生的正中神經(jīng)的CNAP波幅和有髓纖維計數(shù)散點圖顯示沒有線性關(guān)系趨勢，相關(guān)分析顯示相關(guān)系數(shù)為0.39。而每個再生時段，有線性趨勢，切斷縫合后每個時段的6個樣本經(jīng)線性

10、回歸分析，均有線性關(guān)系，斜率較為接近，相關(guān)系數(shù)都在0.92以上，相關(guān)系數(shù)平方在0.81以上。CMAP波幅和抓握力進行非線性回歸分析，并行hyperbolic曲線擬合，結(jié)果表明他們之間存在強的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r2為0.959值。
　　 結(jié)論：對早期的神經(jīng)功能評價，CNAP優(yōu)于CMAP；在術(shù)后不同時段，CNAP波幅與有髓纖維計數(shù)之間有弱的相關(guān)性，但在每一時段，他們之間有線性關(guān)系，各個時段的線性斜率相近，截距不同；在正常正中神經(jīng)，C

11、NAP波幅與有髓纖維計數(shù)之間有線性關(guān)系；在術(shù)后不同時段，CMAP波幅與抓握力有強的正相關(guān)。
　　 實驗二：大鼠正中神經(jīng)再生不同時段電生理(CNAP)、分子生物學特點及他們之間的相關(guān)性分析
　　 目的：研究大鼠正中神經(jīng)損傷修復不同時段分子生物學因素GAP43、MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表達變化及其與電生理參數(shù)的相關(guān)性。
　　 方法：大鼠上臂正中神經(jīng)中段切斷縫合的不同的時間點(從2-12w)，進行CNAP檢

12、測，隨后取6個實驗組縫合口遠端正中神經(jīng)和正常對照組的正中神經(jīng)組織液氮冷凍保存，用實時定量PCR和Westernblot方法檢測GAP43、MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表達變化，最后統(tǒng)計分析CNAP參數(shù)與分子指標的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：術(shù)后第2w開始，可以記錄到CNAP。術(shù)后2，3，4，6，8和12w，再生神經(jīng)記錄的CNAP波幅，包括第一峰波幅(FPA)和峰-峰波幅(PPA)，與正常的CNAP相比，有顯著差異(P<0.01

13、)。波幅面積(Area)也顯著低于正常(P<0.01)。傳導速度(CV)顯著慢于正常對照(P<0.01)。從術(shù)后2到4周，潛伏期(Lat)均比正常明顯延長(P<0.01)。從術(shù)后2到8周，刺激強度(閾強度THI和超大刺激強度SSI)顯著低于正常對照(P<0.01)。神經(jīng)切斷縫合后2w到6w GAP43的mRNA和蛋白水平表達與對照組比較明顯上調(diào)(P<0.01)，8周后開始表達漸漸降低，但12w仍高于正常。切斷縫合后2w至6w，MPZ、N

14、F-L的mRNA表達與對照組比較明顯下調(diào)(P<0.01)，8周、12w后表達增加稍高于正常。切斷縫合后2w至3w，MPZ、NF-L的蛋白表達與對照組比較明顯下調(diào)(P<0.01)，6周接近正常，8w、12w表達增加稍高于正常。遠端記錄的CNAP波幅與MPZ、NF-L的mRNA和蛋白水平表達有正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.615)，與GAP43mRNA和蛋白水平表達有負相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.553)。
　　 結(jié)論：大鼠正中神經(jīng)損傷遠端的分子指

15、標，MPZ、NF-L早期表達低，爾后漸升高，相反，GAP43早期表達很高，之后漸下降。CNAP波幅與其MPZ、NF-L的表達水平表達成正相關(guān)，與其GAP43表達水平表達成負相關(guān)。
　　 第三部分、復合神經(jīng)干動作電位與再生神經(jīng)纖維數(shù)目之間的相關(guān)性研究
　　 目的：大鼠正中神經(jīng)切斷縫合后神經(jīng)再生期間，其復合神經(jīng)動作電位(CNAP)與神經(jīng)再生纖維數(shù)目之間的相關(guān)性研究。
　　 方法：大鼠上臂正中神經(jīng)中段切斷后，用6種不同

16、型號的縫線進行縫合，切斷縫合后的2w和8w，進行CNAP檢測，觀察其參數(shù)變化，然后切取大鼠正中神經(jīng)組織標本(正常、縫合口近端、縫合口遠端)，用半薄切片甲苯胺藍染色、免疫組化、luxol fast blue染色三種形態(tài)學檢測方法進行有髓神經(jīng)纖維計數(shù)，然后用線性回歸方法，分析他們之間相關(guān)性。
　　 結(jié)果：神經(jīng)切斷縫合術(shù)后2w和8w，再生神經(jīng)記錄的CNAP波幅，包括第一峰波幅(FPA)和峰-峰波幅(PPA)，與正常的CNAP相比，有顯

17、著差異(P<0.01)。波幅面積(Area)也顯著低于正常(P<0.01)。三種方法的再生神經(jīng)遠端形態(tài)學觀察，術(shù)后2周，可見許多不完整，破裂的髓鞘，有大量變性的軸突，可見巨噬細胞吞噬髓鞘碎屑的現(xiàn)象；有少量、小的、新生薄髓鞘軸突，薄髓鞘軸突不均勻分布，結(jié)構(gòu)相對紊亂；術(shù)后8周，小的、新生的薄髓鞘軸突明顯增多，有髓軸突比切斷縫合術(shù)后2周直徑明顯增大，僅偶爾可見一些不完整，破裂的髓鞘，很少見巨噬細胞吞噬髓鞘碎屑的現(xiàn)象，薄髓鞘軸突分布不均勻，結(jié)構(gòu)

18、比切斷縫合術(shù)后2周相對排列集中，但仍比正常軸突排列散亂，成族成群的小直徑新生軸突居多。在切斷縫合術(shù)后2w，延伸到縫合口遠端的有髓纖維的總數(shù)約為正常的20％左右，在切斷縫合術(shù)后8w，延伸到縫合口遠端的有髓纖維的總計數(shù)大于正常。在切斷縫合術(shù)后2w和8w，不同型號縫線的各組之間的正中神經(jīng)有髓纖維再生恢復率之間都有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。線性回歸分析，遠端記錄的CNAP波幅與其有髓神經(jīng)纖維計數(shù)之間有強的正相關(guān)(三種方法的相關(guān)系數(shù)均在0.

19、740以上)。CNAP波幅和有髓纖維的計數(shù)之間有強的正相關(guān)，并有線性關(guān)系。直線擬合構(gòu)建的線性方程式為：切斷縫合術(shù)后2周，有髓纖維計數(shù)(y)=波幅(x)K+B，K(190.89-289.81)，B(-256.00-122.53)；切斷縫合術(shù)后8周，y=Kx+B，K(224.39-305.57)，B(2539.47-2750.12)。應用2w的方程y=Kx+B，驗證第二部分實驗2w的波幅和有髓纖維計數(shù)的有效率為95.8％；應用8w的方程y=

20、Kx+B，驗證第二部分實驗8w的波幅和有髓纖維計數(shù)的有效率為96.4％。實驗結(jié)果表明，所得出的線性方程，有較高的符合率。
　　 結(jié)論：大鼠正中神經(jīng)切斷縫合后早期和成熟期，再生神經(jīng)的遠端的CNAP波幅與相應位置的有髓纖維計數(shù)之間均有線性關(guān)系；擬合的線性方程斜率的相近，僅截距有明顯差異，線性方程驗證有較高的符合率，可以在神經(jīng)損傷后再生早期或晚期，根據(jù)電生理CNAP的波幅，通過線性方程計算出損傷遠端的有髓纖維計數(shù)，確定神經(jīng)再生的軸索通