中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體MLPA診斷試劑盒初步研發(fā).pdf

1、神經(jīng)中樞系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）感染是臨床上常見(jiàn)疾病，由于其高致死率和產(chǎn)生嚴(yán)重后遺癥而倍受關(guān)注。快速明確診斷是應(yīng)對(duì)臨床治療非常關(guān)鍵，但是，現(xiàn)有診斷技術(shù)不能達(dá)到此目的。
　　本課題先總結(jié)了常見(jiàn) CNS感染病原物種類，接著針對(duì)神經(jīng)外科手術(shù)感染(Intracranial infection)17種常見(jiàn)細(xì)菌設(shè)計(jì)了一套MLPA探針。由于構(gòu)建MLPA探針?biāo)栀|(zhì)粒等關(guān)鍵試劑一直被荷蘭 MRC-Holland公

2、司壟斷，除了利用合成方法制備短探針外，我們不得不逐步探索一套 MLPA長(zhǎng)探針制備方法。首先我們使用M13噬菌體克隆了17種致病細(xì)菌的MLPA長(zhǎng)探針，并把所得的M13噬菌體載體均通過(guò)了測(cè)序驗(yàn)證以保證這17個(gè)克隆載體均能夠用于制備 MLPA探針，再通過(guò) Bsm I和EcoR V雙酶切法制備獲得長(zhǎng)探針。該種探針制備方法使MLPA探針擴(kuò)大化生產(chǎn)變得簡(jiǎn)單、快速，可以推廣到其他MLPA探針大量制備工藝中。
　　在探針驗(yàn)證方面，我們克隆了17個(gè)

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，這些質(zhì)粒各含有短探針和長(zhǎng)探針DNA序列，經(jīng)過(guò)單靶點(diǎn)和多靶點(diǎn)PCR擴(kuò)增、ABI3500毛細(xì)電泳測(cè)試分析，證明我們制備的MLPA探針具備非常高的靈敏度和靶向性。課題預(yù)計(jì)僅用1 ml M13噬菌體衍生載體液體制備的探針便可滿足10萬(wàn)次左右的MLPA反應(yīng)，凸顯了MLPA的廉價(jià)性，也說(shuō)明了MLPA診斷技術(shù)用于CNS感染病原體診斷有市場(chǎng)潛力。課題也做了探針質(zhì)量控制分析，為進(jìn)一步將探針研發(fā)成可以商品化的診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。總之，所設(shè)

4、計(jì)的MLPA試劑盒具有靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單、便宜等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)CNS感染病原菌診斷具有重要醫(yī)用潛力。
　　本課題也同時(shí)設(shè)計(jì)了針對(duì)腦炎（Encephalitis）、腦膜炎（Cephalomeningitis）等非神經(jīng)外科手術(shù)（Craniotomy）后感染的病原體 MLPA診斷探針。首先，為體現(xiàn)探針的可靠性和科學(xué)性我們爭(zhēng)取每一個(gè)靶位點(diǎn)找到相關(guān)的研究文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，其次，聯(lián)合使用Raw probe、MLPA Probe Verificatio