自組裝型靶向抗腫瘤聚酰胺-胺樹狀分子簇的設計合成與表征.pdf

1、聚酰胺-胺樹狀分子（PAMAM）是一類新興的納米級高分子聚合物，因其水溶性好，單分散性，表面具有密集的可修飾基團等優(yōu)點被廣泛用作腫瘤靶向載體。將各種生物活性小分子（靶向小分子，化療藥物，熒光素，抗原等）分步引入PAMAM載體可以實現(xiàn)腫瘤靶向化療、造影等，但是由于經歷多步反應，各步反應條件、效率不一，最終產物均一性、重現(xiàn)性較差；同時，單個PAMAM表面可修飾位點及溶解性有限，這些問題都限制了單分子PAMAM載體的應用。解決這一問題的辦法之

2、一就是雙分子PAMAM的自我組裝。
　　本文將含氨基末端的第五代聚酰胺-胺樹狀分子（G5-PAMAM）首先與乙酸酐反應，將末端70％氨基?；?，以中和PAMAM表面大部分氨基，改善其生物體內相容性，得到部分?；臉錉罘肿覩5-Ac；然后，在水溶性碳酰亞胺縮合劑EDC作用下，靶向配基（葉酸FA）和化療藥物配基（甲氨蝶呤MTX）分別與70％?；臉錉罘肿颖砻媸Ｓ喟被s合形成酰胺鍵連接，得到G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX；接著，用E

3、DC做縮合劑，咪唑作為催化劑，G5-Ac-FA和G5-Ac-MTX表面剩余氨基分別與5’端磷酸修飾的34堿基長度的互補單鏈寡核苷酸（sON34和cON34）縮合形成磷酰胺共價連接，得到靶向功能端G5-Ac-FA-sON34和化療藥物功能端G5-Ac-MTX-cON34；最后，G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34在磷酸緩沖液（PBS）中退火形成雙鏈DNA，得到G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX，實現(xiàn)了腫瘤

4、靶向功能端和化療藥物功能端的自我組裝。
　　采用電位滴定，紫外-可見光分光光度法（UV-VIS），核磁共振氫譜（1H-NMR），瓊脂糖凝膠電泳等分析方法對各步產物進行了定性和定量分析。
　　先用0.1M鹽酸滴定一定量的PAMAM末端氨基，測得PAMAM末端氨基數(shù)目為117個，然后與70％摩爾比的乙酸酐反應得到乙?；腉5-Ac，核磁共振氫譜結果顯示82個末端氨基被乙?；?，剩余35個氨基，?；壤秊?0％。EDC活化后的葉酸/

5、甲氨蝶呤與PAMAM表面剩余氨基縮合，與PAMAM縮合后，葉酸/甲氨蝶呤的紫外吸收光譜有5-10nm的紅移，同時，核磁共振氫譜中6-9ppm出現(xiàn)了新的質子信號峰且峰形變寬，表明葉酸/甲氨蝶呤與PAMAM形成了共價連接。紫外吸收標準曲線法計算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲氨蝶呤分別為2.4/4.0個，同時，通過比較核磁共振氫譜中PAMAM末端乙?；|子峰和葉酸/甲氨蝶呤結構中蝶啶環(huán)上的芳質子峰積分比，計算出每分子PAMAM連上的葉酸/甲

6、氨蝶呤分別為3.0/5.0個，兩種方法結果基本一致。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示連有葉酸/甲氨蝶呤的PAMAM與單鏈寡核苷酸sON34/cON34連接后幾乎不帶電荷，由于PAMAM表面剩余氨基數(shù)目大約為32個，在PH8.0緩沖液中PAMAM表面帶32個正電荷，而sON34/cON34約帶34個負電荷，這證明了每分子PAMAM上連接的DNA數(shù)目為1。雜化組裝前G5-Ac-FA-sON34和G5-Ac-MTX-cON34分子量分別約為44k，雜化

7、后得到的G5-Ac-FA-DNA-G5-Ac-MTX為淡橙色透明溶液，可以被截留分子量為100k的濾膜截留，說明sON34/cON34與PAMAM之間形成了磷酰胺鍵，而不是通過正負電荷中和形成復合物，sON34與cON34的退火反應實現(xiàn)了PAMAM雙分子自組裝；同時，比較雜化反應前后紫外吸收曲線的變化，發(fā)現(xiàn)在260-280nm處吸收有明顯增加，這一波段是DNA的特征吸收區(qū)域，也佐證了兩分子PAMAM通過DNA實現(xiàn)了自組裝。
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