微電極陣列系統(tǒng)研制及其在體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究中的初步應(yīng)用.pdf

1、離體培養(yǎng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的簡(jiǎn)化模型,對(duì)于研究神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)、記憶、可塑性、連接性和信息處理等相關(guān)神經(jīng)科學(xué)問(wèn)題具有重要的價(jià)值。微電極陣列是一種集成了數(shù)十或者更多個(gè)微采集單元的元件,具有無(wú)損傷性、環(huán)境可控性和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),能夠以無(wú)損的方式長(zhǎng)期、實(shí)時(shí)的檢測(cè)離體神經(jīng)元的電生理活動(dòng),為離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)研究提供了一種有力的研究手段。目前,微電極陣列系統(tǒng)已經(jīng)在神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能連接與再生、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)育規(guī)律研究、生理節(jié)律以及

2、神經(jīng)藥理毒理學(xué)等方面有了大量的應(yīng)用,成為神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)研究領(lǐng)域的重要工具和手段。
　　微電極陣列最早出現(xiàn)于1972年,經(jīng)過(guò)數(shù)十年的發(fā)展,相關(guān)研究已取得了明顯進(jìn)展。出現(xiàn)了多種不同用途的微電極陣列和系統(tǒng),部分常規(guī)微電極陣列和系統(tǒng)已經(jīng)達(dá)到了較高的水平,并且實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化,如德國(guó)MCS系統(tǒng)等。盡管商業(yè)化系統(tǒng)做工精細(xì)、軟件界面美觀人性化、數(shù)據(jù)處理功能強(qiáng)大而且系統(tǒng)穩(wěn)定,但是存在價(jià)格昂貴、易損耗等不足,為相關(guān)研究的大量開(kāi)展帶來(lái)沉重的經(jīng)費(fèi)負(fù)擔(dān)。此外

3、,商業(yè)化的產(chǎn)品功能相對(duì)固定,難以針對(duì)具體的研究要求進(jìn)行改造升級(jí).因此常出現(xiàn)無(wú)法滿足具體實(shí)驗(yàn)需求的情況。基于此,國(guó)內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室均在嘗試開(kāi)發(fā)自己的微電極陣列系統(tǒng),以更好地滿足特定的實(shí)驗(yàn)需求。在基于微電極陣列的離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究中,首先要在微電極陣列上開(kāi)展離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建研究,這一過(guò)程常面臨著幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。如何提升神經(jīng)元在微電極陣列表面粘附與存活是其中的關(guān)鍵問(wèn)題之一。在微電極陣列的制作過(guò)程中,一般會(huì)使用二氧化硅、氮化硅或者一些高聚物材料作為

4、電極導(dǎo)線的絕緣材料,這些材料不能保證優(yōu)良絕緣性的同時(shí)兼具有良好的生物相容性,而且神經(jīng)元本身的細(xì)胞粘附能力較差,因此對(duì)微電極陣列的表面進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?以改善其生物相容性,促進(jìn)神經(jīng)元的粘附,成為基于微電極陣列進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建亟需解決的首要問(wèn)題。國(guó)際上用于微電極陣列表面涂層修飾的材料有:Matrigel、膠原、多聚賴氨酸、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白和聚乙烯亞胺等。其中,Matrigel來(lái)源于天然的細(xì)胞外基質(zhì)成分,富含多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白

5、,具有良好的生物相容性和生物活性,是一種非常優(yōu)良的表面涂層修飾材料。在以往的報(bào)道中,盡管Matrigel已在微電極陣列表面涂層修飾中得到了應(yīng)用,并取得了良好的結(jié)果,但其中的許多關(guān)鍵問(wèn)題尚未得到闡明,尤其是在Matrigel濃度對(duì)神經(jīng)元粘附與存活影響方面,相關(guān)研究尚未報(bào)道。
　　所選擇的細(xì)胞接種密度是否合適是影響構(gòu)建的離體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)質(zhì)量的另一個(gè)重要因素。在微電極陣列表面上進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建時(shí),為了更好地促進(jìn)神經(jīng)元的存活和粘附,研究人員通

6、常會(huì)以較高密度接種。然而,研究表明,不適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元密度對(duì)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活、電活動(dòng)發(fā)育與質(zhì)量等均具有顯著的影響。神經(jīng)元的接種密度如何影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)電信號(hào)質(zhì)量以及獲取高質(zhì)量神經(jīng)電信號(hào)的最佳神經(jīng)元接種密度如何目前仍沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。
　　基于上述分析,本課題首先進(jìn)行了微電極陣列系統(tǒng)的研制,在此基礎(chǔ)之上開(kāi)展基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與條件優(yōu)化研究,進(jìn)一步利用自研的微電極陣列系統(tǒng)與構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究平臺(tái),初步開(kāi)展了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電

7、刺激與藥物刺激反應(yīng)特性研究,以驗(yàn)證本系統(tǒng)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)研究中的適用性和可靠性。本課題的主要研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分:微電極陣列的制備及多通道電生理檢測(cè)系統(tǒng)的研制。
　　本部分研究利用印刷電路板開(kāi)發(fā)技術(shù)進(jìn)行了多通道電生理檢測(cè)系統(tǒng)硬件部分的制備,開(kāi)發(fā)了基于LabVIEW的數(shù)據(jù)采集軟件系統(tǒng),并使用微加工技術(shù)進(jìn)行了平面微電極陣列、瓊脂糖井型微電極陣列和印章圖形化微電極陣列的制作。
　　所研制的多通道采集系統(tǒng),輸

8、入噪聲Vrms<2yV、帶寬為10~10000Hz、放大倍數(shù)為1000倍、多通道采樣頻率最高可達(dá)20KHz,可以進(jìn)行32通道的數(shù)據(jù)采集、濾波和存儲(chǔ),總共造價(jià)小于3萬(wàn)人民幣,其造價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于商業(yè)系統(tǒng)的售價(jià)(超過(guò)50萬(wàn)元)。所研制的平面微電極陣列具有較好的電學(xué)特性,可用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究,此外本研究成功研制了瓊脂糖井型微電極陣列和印章圖形化微電極陣列。
　　第二部分:基于平面微電極陣列的二維神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的制備與條件優(yōu)化研究。
　　本部分研

9、究使用不同濃度的Matrigel鋪板,并將分離培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元接種在微電極陣列上,觀察其對(duì)細(xì)胞粘附和活力的影響,摸索最佳的Matrigel鋪板濃度。然后,在最佳Matrigel濃度鋪板下,在微電極陣列的表面按照500個(gè)/mm/、1000個(gè)/mm/、2000個(gè)/mm/、4000個(gè)/mm/和8000個(gè)/mm25種密度進(jìn)行接種,以期獲得信號(hào)質(zhì)量較高的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)果表明,本部分研究成功分離出了皮層神經(jīng)細(xì)胞,免疫熒光結(jié)果表明,7天的

10、皮層培養(yǎng)物中包含MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元、GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞等。將微電極陣列以不同濃度Matrigel鋪板之后,細(xì)胞的粘附情況不同,低濃度Matrigel鋪板的微電極陣列上細(xì)胞粘附數(shù)量較少,高濃度Matrigel鋪板的微電極陣列上粘附數(shù)量增多,但是容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,微電極陣列使用濃度為0.2-0.4mg/mL的Matrigel鋪板后神經(jīng)元粘附的數(shù)量較多且均勻性最好。不同細(xì)胞密度接種的微電極陣列上細(xì)胞培養(yǎng)物的MAP2免疫熒光染色結(jié)果表

11、明,隨著接種密度的增加,MAP2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)也會(huì)增加,但是相比于2000個(gè)/mm/的接種密度而言,8000個(gè)/mm/接種密度條件下MAP2陽(yáng)性的數(shù)量?jī)H增加了不足2倍,細(xì)胞核染色結(jié)果表明不同接種密度構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)14天后存活的細(xì)胞密度相似。信號(hào)記錄的結(jié)果表明,神經(jīng)培養(yǎng)物培養(yǎng)約l周開(kāi)始出現(xiàn)電活動(dòng),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的電活動(dòng)逐漸增加。比較而言,以2000個(gè)/mm/細(xì)胞接種密度構(gòu)建的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在培養(yǎng)過(guò)程中可以檢測(cè)到最為頻繁的脈沖和同

12、步簇發(fā)放電活動(dòng)。
　　第三部分:基于平面微電極陣列神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激與藥物刺激反應(yīng)特性研究。
　　在基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電刺激反應(yīng)特性研究方面:
　　本部分研究使用自研的微電極陣列系統(tǒng),分別對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行先正后負(fù)和先負(fù)后正不同強(qiáng)度的電脈沖刺激來(lái)確定最佳的電流脈沖刺激條件。然后在細(xì)胞培養(yǎng)第10天、14天、18天、22天時(shí),分別對(duì)16個(gè)電極進(jìn)行電刺激同時(shí)記錄其他電極的響應(yīng)情況,進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自發(fā)發(fā)育過(guò)程中的電刺激一響應(yīng)性特征

13、的研究。
　　結(jié)果表明,先負(fù)后正強(qiáng)度為lOyA的電流刺激(正負(fù)相持續(xù)時(shí)間均為400ys)施加在活性電極(有自發(fā)電活動(dòng)的電極)幾乎可以l00％的誘發(fā)出響應(yīng),重復(fù)10次刺激獲得響應(yīng)的結(jié)果除了響應(yīng)信號(hào)為自發(fā)電活動(dòng)的可能。在細(xì)胞培養(yǎng)第10天、14天、18天、22天時(shí),對(duì)16個(gè)電極進(jìn)行重復(fù)電刺激后繪制的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)刺激一響應(yīng)性特征圖譜,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接數(shù)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加,培養(yǎng)至22天時(shí)大部分的電極之間都存在著刺激一響應(yīng)性。這一研究結(jié)果與文

14、獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)結(jié)果相一致,表明自研的微電極陣列系統(tǒng)具有可靠性和穩(wěn)定性,并可以聯(lián)合電刺激手段進(jìn)行神經(jīng)生物學(xué)方面的相關(guān)研究。
　　在基于微電極陣列的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥物刺激反應(yīng)特性研究方面:
　　本部分研究使用自研的微電極陣列系統(tǒng),考察不同濃度L-谷氨酸鈉和GABA刺激對(duì)微電極陣列上神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電活動(dòng)的影響,來(lái)驗(yàn)證自研系統(tǒng)在藥物評(píng)價(jià)方面的適用性。
　　結(jié)果表明,在一定的濃度范圍內(nèi),隨著L一谷氨酸鈉的濃度的增加,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平均脈沖率與平均簇

15、發(fā)放電率均表現(xiàn)為增加的趨勢(shì),達(dá)到平臺(tái)期后隨著藥物濃度的增加,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)反而會(huì)由于L一谷氨酸鈉的興奮性神經(jīng)毒性而受到一定抑制。v一氨基丁酸(GABA)為腦內(nèi)的重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),在本研究中,其對(duì)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響與濃度相關(guān),隨著濃度的增加,神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的平均脈沖率、平均簇發(fā)放電率均下降,且在濃度為lOltM時(shí),神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的信號(hào)被完全抑制。上述藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果符合藥物作用效能,與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)結(jié)果相一致,表明自研的微電極陣列系統(tǒng)