中國林蛙皮膚生物活性肽的分離純化及其部分生物活性的研究.pdf

1、中國林蛙(Ranachensinensis)是我國東北地區(qū)長白山末麓集藥、食、補于一體的珍貴蛙種，也是遼寧地區(qū)優(yōu)勢藥用價值動物資源之一。目前，國內(nèi)針對中國林蛙的研究多見于雌性中國林蛙輸卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的報道，而對中國林蛙皮膚活性物質(zhì)的研究少有報導。蛙類皮膚中含有大量的具有特殊分子結(jié)構(gòu)、功能復雜多樣的生物活性物質(zhì)，具有重要的應用價值及較大的開發(fā)利用潛力。著眼于疾病治療因子的篩選和生物活性分子的發(fā)現(xiàn)，如果能從中國林蛙皮膚中

2、分離提取到具有重要應用價值的生物活性物質(zhì)，必能豐富“北藥”資源，為更有效的開發(fā)利用中國林蛙資源奠定堅實的基礎。 本論文選擇長白山末麓的撫順、本溪縣等地山區(qū)的中國林蛙為試驗材料，提取其皮膚中的生物活性肽，并通過對提取體系、抽提溫度、抽提時間等因素進行正交試驗的篩選優(yōu)化，確定了活性肽較好且適合工業(yè)生產(chǎn)的提取條件和技術(shù)路線。 中國林蛙皮膚中小分子生物活性肽對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌都具有一定的抗菌活性。對大腸埃希氏菌、金黃色

3、葡萄球菌、短小芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、枯草芽胞桿菌和乳鏈球菌的抑菌效果好于嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌，其MIC值為1.25mg/mL和2.5mg/mL，明顯低于嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌的MIC值10mg/mL和5mg/mL。而且抗菌效果優(yōu)于傳統(tǒng)的食品防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，其抑菌效果是山梨酸鉀的數(shù)十倍。 將S180胃肉瘤細胞接種至小鼠皮下，選取中國林蛙皮膚生物活性肽不同濃度樣品液，連續(xù)注射種瘤小鼠15天后，計算抑瘤率；采用透

4、射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化、DNA梯度瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、MTT比色法、流式細胞檢測等技術(shù)觀察中國林蛙皮膚生物活性肽對K562腫瘤細胞凋亡過程的誘導。 體內(nèi)試驗結(jié)果表明，中國林蛙皮膚生物活性肽組分FⅢ對小鼠S180胃肉瘤細胞有明顯的抑制作用。體外試驗結(jié)果表明，中國林蛙皮膚生物活性肽組分FⅢ可以誘導K562、MCF·7、SKOV3、Hela、HepG2和7721等腫瘤細胞凋亡，其中對K562和MCF·7細胞的抑制作用最為明顯，其IC

5、50值分別為0.1569mg/mL和0.1373mg/mL。而且，誘導K562腫瘤細胞凋亡的試驗結(jié)果表明，顯微鏡下觀察可見細胞膜破損、細胞變形或出現(xiàn)胞芽和縊痕，透明度和亮度均降低，細胞內(nèi)出現(xiàn)有異物感的顆粒，細胞增殖作用減低，活細胞數(shù)減少；電鏡下觀察，細胞皺縮變小，胞漿致密，核固縮，染色質(zhì)濃集、邊聚化，形成不同形狀大小的塊狀，胞質(zhì)空泡化等。流式細胞分析顯示，中國林蛙皮膚生物活性肽作用后，K562細胞S期DNA含量遠遠高于G1期DNA含量的