缺氧誘導(dǎo)因子1α與著絲粒蛋白W在人膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[1,2]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見、難治的原發(fā)性惡性腫瘤[3]，大約占顱內(nèi)腫瘤的一半[4]。既往有相關(guān)調(diào)查表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲等過程都是多階段的、多種基因參與的結(jié)果[5]，但是其中的具體機(jī)制至今尚不明了[5]。
　　著絲粒蛋白 W（centromere protein W，CENP-W）又稱腫瘤上調(diào)蛋白2（cancer-up-regulated gene2，CUG2）基因，是2007年發(fā)現(xiàn)

2、的一種致癌基因[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CENP-W在卵巢、肝臟、肺、胰腺和結(jié)腸等惡性腫瘤組織中普遍存在高表達(dá)[8,9]。它的過表達(dá)既可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，另一方面又可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[10]，具有很復(fù)雜的作用機(jī)制[11]。實(shí)驗(yàn)證明，CENP-W的過表達(dá)可誘發(fā)腫瘤形成[12]，與人體各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遷徙等過程有重要關(guān)系。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypo xia ind uc ib le facto r-1α，HIF-1α）是缺氧環(huán)境誘導(dǎo)下細(xì)

3、胞產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子[13,14]，可調(diào)控多種靶基因的表達(dá)[15]，它在一般環(huán)境中很容易分解[16]。然而，目前CENP-W與HIF-1α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)相關(guān)性尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　目的：
　　本研究以Ⅰ～Ⅳ級(jí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織、瘤旁腦組織和U251膠質(zhì)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測(cè)HIF-1α與CENP-W在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其相關(guān)性，探討它們與膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為的關(guān)系，以期為膠質(zhì)瘤的防治提供一些依據(jù)。
　　方法：

4、
　　第一部分應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)41例含不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本、3例瘤旁腦組織標(biāo)本中HIF-1α和CENP-W的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析蛋白表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系，以及兩蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。
　　第二部分應(yīng)用不同濃度氯化鈷[17]抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中HIF-1α的分解，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)C ENP-W mRNA表達(dá)的變化，24h后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中C ENP-W

5、蛋白的表達(dá)的變化，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，探索當(dāng)HIF-1α含量升高時(shí)對(duì)U251細(xì)胞中C ENP-W蛋白及mRNA表達(dá)的影響。
　　第三部分應(yīng)用特異性小干擾 RNA（small interference RNA，siRNA）干擾U251細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)使其下調(diào)后，采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法分別檢測(cè)CENP-W蛋白及mRNA表達(dá)的變化。應(yīng)用特異性siRNA干擾U251細(xì)胞中CENP-W表達(dá)使其下調(diào)后，采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)

6、時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè) HIF-1α蛋白及mRN A表達(dá)的變化，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析結(jié)果，進(jìn)一步探索U251細(xì)胞中HIF-1α和C ENP-W表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果提示 CENP-W主要表達(dá)于細(xì)胞核，有明顯的異質(zhì)性，在瘤旁正常組織、低級(jí)別（Ⅰ～Ⅱ）和高級(jí)別（Ⅲ～Ⅳ）膠質(zhì)瘤標(biāo)本中其表達(dá)陽性率分別是67％（2/3）、82%（14/17）和92%(22/24)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示各組CENP-W表達(dá)率之

7、間沒有明顯差異（χ2＝1.794，P＝0.408）；但比較免疫組織化學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，高級(jí)別組評(píng)分（3.58±1.06）普遍比低級(jí)別組（2.88±1.50）高，其中瘤旁組評(píng)分（2.00±2.00）最低。HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞核，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中有少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，有明顯的異質(zhì)性；在瘤旁正常組織、低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中其表達(dá)陽性率分別是0%（0/3）、47%（8/17）和79%(19/24)，各組表達(dá)陽性率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.

8、440，P＝0.009）。另外，CENP-W和HIF-1α在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與患者性別、年齡及膠質(zhì)瘤病理類型均沒有明顯的關(guān)系。
　　2.氯化鈷模擬缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)50μmo l/L氯化鈷處理膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞24～48 h后，細(xì)胞生長狀況和未經(jīng)氯化鈷處理的細(xì)胞相比無明顯不同，顯微鏡下可見處理組細(xì)胞生長良好，同條件下細(xì)胞密度較高，細(xì)胞形態(tài)無明顯異常。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，50μmol/L氯化鈷處理U251細(xì)胞24 h后，HI

9、F-1αmRNA表達(dá)水平無明顯變化（t＝1.965，P=0.08），CENP-W mRNA表達(dá)水平升高（t＝18.263，P＜0.01）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，50μmo l/L氯化鈷處理U251細(xì)胞48 h后，HIF-1α蛋白的表達(dá)水平明顯升高（t＝10.271，P＜0.01），CENP-W蛋白表達(dá)水平也明顯升高（t＝7.813，P＜0.01）。
　　3.HIF-1a siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞36 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR

10、結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA組HIF-1αmRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（q＝10.01，P＜0.01）和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組（q＝9.64，P＜0.01）明顯降低，CENP-W mRNA表達(dá)水平也較明顯下降（q＝9.95，P＜0.01；q＝10.52，P＜0.01），2個(gè)對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染HIF-1αs iRN A組HIF-1α蛋白表達(dá)水平較2個(gè)對(duì)照細(xì)胞組明顯降低（q＝6.95，P＜0.

11、01；q＝7.59，P＜0.01），CENP-W蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)下降（q＝5.01，P＜0.05；q＝5.82，P＜0.01），2個(gè)對(duì)照組之間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞36 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA組CENP-W mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（q＝9.43，P＜0.01）和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組（q＝8.95，P＜0.01）明顯降低；然而

12、，HIF-1αmRNA表達(dá)水平在3組之間無明顯變化（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染C ENP-W siRNA組CENP-W蛋白表達(dá)水平較2個(gè)對(duì)照組明顯降低（q＝5.74，P＜0.01，q＝5.39，P＜0.05），而HIF-1α蛋白表達(dá)水平無明顯變化（q＝2.95，q＝2.64，P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.以瘤旁腦組織做為對(duì)照，HIF-1α和CENP-W在膠質(zhì)瘤標(biāo)本均存在高表達(dá)，與腫瘤級(jí)別呈正相關(guān)，且HIF-

13、1α和CENP-W在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)呈一定的相關(guān)性，提示HIF-1α和CENP-W可能共同參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.應(yīng)用氯化鈷模擬缺氧實(shí)驗(yàn)，成功證明當(dāng)U251細(xì)胞中HIF-1α適量積聚時(shí)，細(xì)胞中CENP-W的表達(dá)也升高，表明HIF-1α可能調(diào)節(jié)U251細(xì)胞CENP-W的表達(dá)。
　　3. HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后CENP-W的表達(dá)也隨之降低，進(jìn)一步表明HIF-1α可能調(diào)節(jié)U251細(xì)胞C ENP-W