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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
免疫炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)損傷中繼發(fā)損傷的重要因素,貫穿繼發(fā)損傷的始終。過(guò)去十多年隨著神經(jīng)免疫學(xué)的發(fā)展,免疫反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用得到了廣泛的研究,但并未得出一致性的結(jié)論。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為CNS是免疫豁免器官,任何浸潤(rùn)其中的外周免疫細(xì)胞都是有害的,應(yīng)當(dāng)予以抑制以減輕繼發(fā)損傷[1];而其它研究發(fā)現(xiàn)CNS損傷后主動(dòng)或被動(dòng)用CNS自身抗原免疫動(dòng)物提高自身免疫T細(xì)
2、胞的數(shù)量和活性都能明顯增加損傷后神經(jīng)元的存活,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[2],但具有這種保護(hù)作用的 T細(xì)胞的具體亞型仍不清楚。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是一類自然產(chǎn)生的能控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細(xì)胞亞群,表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3,對(duì)自身抗原有很高的親和力,通過(guò)直接接觸或分泌抗炎因子IL-10,TGFβ等抑制T細(xì)胞的增殖和活化[3]。近年對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究主要集中在腫瘤和自身免疫性疾病中,CNS損傷后Treg
3、細(xì)胞的作用及其機(jī)制,以及其對(duì)于CNS損傷后免疫反應(yīng)的作用如何尚不清楚。
免疫反應(yīng)按參與的細(xì)胞和反應(yīng)時(shí)序不同可分為固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng),二者之間相互聯(lián)系,相互作用,共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。巨噬細(xì)胞是機(jī)體一大類重要的固有免疫細(xì)胞,在損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用。CNS損傷后損傷區(qū)有兩種不同來(lái)源的巨噬細(xì)胞,一種是CNS固有的小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生,一種是血液?jiǎn)魏思?xì)胞浸潤(rùn)至損傷區(qū)產(chǎn)生,這兩種細(xì)胞在形態(tài)和表面標(biāo)記上目前都無(wú)法區(qū)分,因
4、此被統(tǒng)稱為巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞[4],但它們?cè)趽p傷后的具體作用是否完全一致仍有待研究。巨噬細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子環(huán)境下能向不同方向極化,進(jìn)而產(chǎn)生不同的作用。在LPS和IFN-γ存在的條件下細(xì)胞通過(guò)經(jīng)典活化途徑向 M1方向活化,產(chǎn)生 TNFα和IL-1β等促炎因子,并高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合梅(iNOS),產(chǎn)生大量氧自由基。而在IL-4和IL-13的作用下,細(xì)胞則向M2方向活化,產(chǎn)生IL-10和TGFβ等抗炎因子,并高表達(dá)精氨酸酶1(argina
5、se1)同iNOs競(jìng)爭(zhēng)底物精氨酸,能促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織重塑[5]。研究顯示 CNS損傷后而 M2型活化的巨噬細(xì)胞有神經(jīng)保護(hù)作用[6]。但具體是何種因素誘導(dǎo)和維持巨噬細(xì)胞的這種表型現(xiàn)在仍不清楚。
目的:
1.研究CNS損傷后的免疫反應(yīng)類型;
2.研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在CNS損傷中的作用及其機(jī)制;
3.觀察 CNS損傷后損傷區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞和血液?jiǎn)魏思?xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞之間的差異,及其對(duì)損傷恢復(fù)的
6、影響。
方法:
1.采用視神經(jīng)夾傷模型,計(jì)數(shù)熒光金逆行標(biāo)記的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC),采用脊髓中度撞擊傷模型(100kDy),用BMS(Basso Mouse Scale)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的情況;
2.給予地塞米松腹腔注射抑制免疫反應(yīng)觀察其對(duì) CNS損傷后神經(jīng)元存活和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,摘除CNS引流淋巴結(jié),觀察其對(duì)視神經(jīng)損傷后RGC存活的影響;3.流式
7、細(xì)胞術(shù)檢測(cè) CNS損傷后不同淋巴結(jié)內(nèi) CD4+T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD4+),CD8+T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD8+),調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3+),效應(yīng)T細(xì)胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3-)的數(shù)量和比例;
4.清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法:采用CD25單克隆抗體(克隆號(hào):PC61)腹腔注射,或采用DEREG轉(zhuǎn)基因小鼠(在foxp3基因啟動(dòng)子下帶有白喉毒素受
8、體基因)腹腔注射白喉毒素以清除表達(dá)foxp3和白喉毒素受體的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;
5.增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法:尾靜脈回輸體外全反式視黃酸(all-trans retinoic acid,ATRA)和TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;
6.采用嵌合體小鼠(UBC-GFP小鼠的骨髓移植進(jìn)輻照過(guò)的野生型小鼠體內(nèi),血液來(lái)源的細(xì)胞均表達(dá)GFP,而CNS固有的小膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)GFP),CCR2 KO小鼠以及CCR2-RFP轉(zhuǎn)基因小鼠觀
9、察CNS損傷區(qū)巨噬細(xì)胞arginase-1的表達(dá)情況;
7.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)損傷區(qū)CD4+T細(xì)胞,CD11b+巨噬細(xì)胞,F(xiàn)oxp3+細(xì)胞的數(shù)目,以及arginase-1的表達(dá)情況;
8. qPCR檢測(cè)損傷區(qū)炎癥因子,arginase-1,以及nos2等基因的表達(dá)情況;
結(jié)果:
1.視神經(jīng)損傷后,頸深淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)目均明顯增多而CD8+T細(xì)胞比例降低,頸深淋巴結(jié)內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效
10、應(yīng)T細(xì)胞的比例相對(duì)于損傷后皮膚引流淋巴結(jié)以及未損傷組的頸深淋巴結(jié)均升高。頸深淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細(xì)胞IL-4表達(dá)增多,能促使體外培養(yǎng)的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞表達(dá)arginase-1;
2.摘除頸深淋巴結(jié)小鼠視神經(jīng)損傷后RGC存活明顯減少;地塞米松抑制免疫反應(yīng),其處理組視神經(jīng)損傷后 RGC的存活明顯少于對(duì)照組,其脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能BMS評(píng)分也明顯低于對(duì)照組,
3.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CNS損傷的作用有劑量差異效應(yīng),即用25μgP
11、C61抗體或4μg/kg白喉毒素少量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能明顯增加存活的神經(jīng)元數(shù)目,而用250μg PC61或40μg/kg白喉毒素大量或完全清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則產(chǎn)生相反的作用。實(shí)驗(yàn)中神經(jīng)元的存活同損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)相關(guān),即低劑量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞使損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)明顯增加,而大量清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞后視神經(jīng)損傷區(qū)arginase-1的表達(dá)明顯減少;
4.靜脈回輸體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能明顯減少視神經(jīng)損傷
12、后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活,同時(shí)其損傷區(qū)表達(dá)arginase-1的巨噬細(xì)胞比例減少,且損傷區(qū)抗炎因子IL-10的表達(dá)也明顯減少;
5.嵌合體小鼠CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1+的細(xì)胞大部分都為GFP+,CCR2 KO小鼠CNS損傷后損傷區(qū)缺乏arginase-1+的細(xì)胞,且CCR2-RFP小鼠脊髓損傷后損傷區(qū)arginase1+的細(xì)胞多為RFP+;
6. CCR2 KO小鼠在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活以及脊髓損
13、傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)方面均明顯差于野生型小鼠。
結(jié)論:
1. CNS損傷后外周的免疫反應(yīng)主要發(fā)生在其引流淋巴結(jié)頸深淋巴結(jié)內(nèi),表現(xiàn)為以CD4+T細(xì)胞為主導(dǎo)的免疫反應(yīng),調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞均有增加,并且這種免疫反應(yīng)具有神經(jīng)保護(hù)作用;
2.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)CNS損傷后的保護(hù)性免疫反應(yīng)具有抑制作用,增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能抑制免疫反應(yīng)對(duì)CNS損傷的保護(hù)作用;而適當(dāng)減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目,減輕其對(duì)保護(hù)性免疫反應(yīng)的抑制,能提
14、高CNS損傷后神經(jīng)元的存活,但過(guò)分減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能使免疫反應(yīng)過(guò)度活化而產(chǎn)生相反的作用,提示臨床上應(yīng)用調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞治療CNS損傷應(yīng)尤為謹(jǐn)慎;
3. CNS損傷后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并不進(jìn)入損傷區(qū),而可能是在外周直接或間接作用于單核細(xì)胞,改變進(jìn)入損傷區(qū)的單核巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)而發(fā)揮其作用的;
4. CNS損傷后損傷區(qū)arginase-1主要表達(dá)在血源性單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞上,而小膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)arginase-1,且
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