表面改性的PHBHHx的體外相容性研究.pdf

1、目的：
　　 動脈粥樣硬化性疾病(AS)是嚴(yán)重危害人類健康的一大類疾病,在發(fā)達國家被稱為“頭號殺手”,是世界范圍的主要死亡因為之一。資料顯示,1999年全世界死亡人數(shù)約5860萬.其中因冠心病死亡人數(shù)高達860萬,位居死因第1位。我國動脈粥樣硬化性疾病發(fā)病雖沒有西方國家那么高,但正呈上升趨勢發(fā)展。Mustardt等指出,動脈粥樣硬化心臟病是導(dǎo)致發(fā)病和死亡的因為之一,這種疾病使得動脈管徑狹窄,最終使血管堵塞。在此背景下,血管支架因

2、其獨特的成型性和生物相容性成為治療心血管疾病的重要技術(shù),近年來在國內(nèi)外己被廣泛應(yīng)用。
　　 理想的血管支架應(yīng)具有以下特征:(1)良好的生物相容性,尤其是血液相容性,即非致血栓性和無免疫原性；(2)適當(dāng)?shù)臋C械性能,包括適當(dāng)?shù)膹姸群晚槕?yīng)性；(3)適當(dāng)?shù)纳硇阅?對神經(jīng)或化學(xué)刺激能做出較好收縮/舒張反應(yīng)；(4)生產(chǎn)周期短、成本低,而且規(guī)格和尺寸齊全能滿足臨床需要。
　　 據(jù)報道,全世界每年有300萬人接受心血管支架置人手術(shù),但

3、其置入術(shù)后血管再狹窄問題卻始終未能得到徹底解決。人們進行了多方面的嘗試和努力,發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞完整性的破壞及功能紊亂與支架植入后血管再狹窄有著密切的關(guān)系,提出將改善內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,EC)功能及完整性的恢復(fù)作為預(yù)防再狹窄的新策略。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞不僅是介于血管壁和血液之間的屏障結(jié)構(gòu)。而且是體內(nèi)一種代謝十分活躍的細(xì)胞,能合成和分泌多種生物活性物質(zhì),如分泌一氧化氮、前列環(huán)素等活性物質(zhì),可有效防止血栓形成,維持

4、血管收縮、舒張,凝血與抗凝血等動態(tài)平衡,在血管腔的表面形成一抗凝血和抗血栓系統(tǒng),另外內(nèi)皮細(xì)胞同血細(xì)胞一樣表面帶負(fù)電荷,因而具有抗血小板聚集、防止血液凝固和血栓形成的作用,從而保持血液的正常流動和血管的長通暢。人工血管與自體血管的主要區(qū)別是無內(nèi)皮細(xì)胞襯里,所以如何使人工血管內(nèi)皮化,顯得尤為重要。
　　 總之,血管內(nèi)支架內(nèi)皮化是解決血管內(nèi)支架置人后血栓形成和提高遠期通暢率很有前途的方法之一,通過從細(xì)胞和分子水平深入研究材料與特定細(xì)胞

5、、組織之間的表面/界面作用,并研究材料學(xué)因素和生物化學(xué)因素及二者相互作用對細(xì)胞的黏附、生長、增殖、分化、基因表達和調(diào)控、生理功能的影響因素和規(guī)律,進而闡明生物醫(yī)學(xué)材料與目標(biāo)物質(zhì)之間的分子識別規(guī)律,進而加強血管內(nèi)支架體外內(nèi)皮化的基礎(chǔ)研究將為其臨床應(yīng)用效果的改善成為可能。
　　 多羥基抗生素類(PHAs)是一類可以由很多種類微生物自然產(chǎn)生的,具有良好生物相容性的生物可降解的共聚物。在PHAs家族中第一個,也是研究最深入的就是具有高結(jié)

6、晶性的3-羥基丁酸聚合物,即PHB。低分子量的PHB在血液中的終產(chǎn)物是3-羥基丁酸,一種普通的代謝產(chǎn)物,并且在高級動物的試驗中也證明,PHB移植物是無毒的。然而,PHB的脆性和低力學(xué)強度明顯限制了它的廣泛應(yīng)用。因此,PHA家族中具有更好機械學(xué)性能和熱力學(xué)穩(wěn)定性的材料,諸如3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)便成為了更有實際應(yīng)用價值的材料。目前,體外試驗已證明-了PHBHHx對一些細(xì)胞的生物相容性非常好,如軟骨細(xì)胞,骨髓間充質(zhì)

7、干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞?？紤]到通過改變其組成的不同組分可以改變它的力學(xué)特性的特點,相信PHBHHx一定能更好的滿足力學(xué)特性要求高的骨組織工程和彈性要求好的血管組織工程的要求。本實驗PHBHHx材料經(jīng)NaOH處理及添加了不同比例的中藥涂層改性后,采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞與其進行復(fù)合培養(yǎng)后,利用形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)以及細(xì)胞生長活力等多個指標(biāo)進行分析,從而探討表面改性PHBHHx在將來心血管支架應(yīng)用中的潛在優(yōu)勢,進

8、一步促進經(jīng)過表面改性的PHBHHx在臨床的早日應(yīng)用。
　　 方法：
　　 體重100g雄性wistar大鼠脫頸椎處死,通過全骨髓培養(yǎng)法獲得相對均質(zhì)的BMSCs,細(xì)胞爬片,固定,進行CD44、CD106免疫熒光染色鑒定。取產(chǎn)后4 h內(nèi)的健康新生兒臍帶,通過胰酶消化法,獲得相對均質(zhì)的HUVECs,細(xì)胞爬片,固定,進行vWF、FLK-1免疫化學(xué)染色鑒定。用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞與表面改性的PHBHHx進行復(fù)合培養(yǎng)后

9、,利用掃描電鏡觀察、免疫熒光染色、中性紅染色及MTT法等多個指標(biāo)進行分析其體外相容性。
　　 結(jié)果：
　　 一、HUVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 原代培養(yǎng)3d后,HUVECs匯合成單層細(xì)胞。傳代培養(yǎng)的HUVECs 30min即貼壁,2-3d融合成單層。形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形或多邊形,大小均勻。細(xì)胞生長融合形成單層后,呈典型的鵝卵石或鋪路石鑲嵌狀排列生長,并有接觸抑制現(xiàn)象,具有內(nèi)皮細(xì)胞特征。vWF

10、、FLK-1免疫化學(xué)染色顯可見胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒,核周密集,而對照組內(nèi)未見著色。
　　 二、MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 BMSCs原代培養(yǎng)接種后12h可見少數(shù)細(xì)胞開始貼壁,細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣,并很快形成集落。24h后首次換液,3天后細(xì)胞增殖加快,呈集落樣迅速長,10～12天后細(xì)胞達到80％融合,3代后BMSCs呈梭形,細(xì)胞核較大、核仁明顯,95％以上形態(tài)均勻一致,CD44及CD106相關(guān)抗原免疫熒光染色陽性,對照組未

11、見熒光。同時向骨和脂肪組織誘導(dǎo)成功。
　　 三、HUVECs、BMSCs在PHBHHx表面上的生長情況
　　 在掃描電鏡下可見,制備的材料為三維疏松多孔的結(jié)構(gòu)。
　　 與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)8、12、24h.,可見材料表面均有細(xì)胞附著,細(xì)胞已伸展成梭形或不規(guī)則形,伸出偽足粘附材料上,細(xì)胞間無聯(lián)系。在經(jīng)過表面改性的材料表面,可見部分細(xì)胞跨越并覆蓋孔隙,細(xì)胞連接增多。熒光顯微鏡下可見人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在加5％、10％中藥涂

12、層及堿處理的材料表面生長良好,己部分融合,且形態(tài)規(guī)則,具有鋪路石樣特征。然而在未經(jīng)改性或未加藥的材料表面較稀疏,分布不均勻。
　　 與BMSCs復(fù)合培養(yǎng)1、3、7 d,可見材料表面均有細(xì)胞附著,細(xì)胞已伸展成梭形或多角形,伸出偽足粘附材料上,細(xì)胞表面有大量的微絨毛,并可見許多處于分裂相的細(xì)胞。中性紅染色后觀察,可見BMSCs在加5％、10％中藥涂層或堿處理的材料表面生長良好,形態(tài)規(guī)則,且分布均勻,呈梭形或多邊形,并有典型的集落樣單

13、位出現(xiàn)。然而在未經(jīng)堿處理或未加中藥涂層的材料表面細(xì)胞較稀疏,且形態(tài)不規(guī)則,無典型的集落樣單位出現(xiàn)。
　　 四、MTT法檢測HUVECs、BMSCs在材料上的增殖情況
　　 縱向比較,PHBHHx組和對照組的吸光度OD值都隨時間延長而逐漸增高(p<0.05)。橫向比較,0％未改性、0％改性、5％未改性、5％改性、10％未改性、10％改性各組的吸光度OD值都隨組的順序而逐漸升高(p<0.05),但對于HUVECs,0％改性和

14、5％未改性,10％未改性和10％改性無顯著性差異,對于BMSCs,0％改性組和5％未改性組無顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)表面改性處理的、且加入5％、10％中藥涂層的PHBHHx膜,具有良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相容性,在體外細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境下,有利于細(xì)胞的生長、貼附和增殖。
　　 2、經(jīng)過堿處理及添加5％、10％中藥涂層的PHBHHx材料與BMSCs有良好的體外相容性,可以作為一種新型材料而逐步應(yīng)用于骨組織