HCMV皮層蛋白pUL76非保守C端與染色體損傷的研究.pdf

1、目的：本研究通過構(gòu)建人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）皮層蛋白pUL76的保守N端和非保守C端的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞，確定pUL76引起染色體損傷的決定序列。
　　方法：通過PCR方法獲取HCMV AD169株UL76基因的全長(zhǎng)，保守N端和非保守的C端的編碼序列并在擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端分別加上BamHI和HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)，然后構(gòu)建至綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-N1。構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別

2、命名為pEGFP-UL76，pEGFP-UL76N,pEGFP-UL76C。將構(gòu)建的質(zhì)粒通過雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證后分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和HF細(xì)胞，IFA檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組染色體損傷信號(hào)γ-H2AX與綠色熒光蛋白的共定位情況，WB檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組染色體損傷信號(hào)γ-H2AX的相對(duì)表達(dá)量。彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞染色體損傷狀況。
　　結(jié)果：
　　1.雙酶切和測(cè)序結(jié)果顯示pUL76全長(zhǎng)、保守N端和非保守的C端編碼序列均正確克隆至真核表達(dá)

3、載體pEGFP-N1，用EGFP抗體做WB顯示各片段均正確表達(dá)。
　　2.單獨(dú)轉(zhuǎn)染pUL76全長(zhǎng)或非保守C端，IFA結(jié)果顯示γ-H2AX與 EGFP融合蛋白共定位，且 WB結(jié)果顯示γ-H2AX相對(duì)表達(dá)量較轉(zhuǎn)染空載體（pEGFP-N1）對(duì)照組上升差異有顯著性。單獨(dú)轉(zhuǎn)染pUL76保守 N端，γ-H2AX與EGFP融合蛋白不出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，WB結(jié)果顯示γ-H2AX相對(duì)表達(dá)量較轉(zhuǎn)染空載體（pEGFP-N1）對(duì)照組上升差異沒有顯著性。