千里光肝臟毒性研究.pdf

1、千里光屬植物Seneciospp.在世界各地分布廣泛，全球約有1500多種，我國約有160余種，其中藥用品種38種。本研究采用千里光總生物堿、千里光單味藥提取物、千柏鼻炎片進行平行比較，結(jié)合化學(xué)研究和PAs含量測定，從急性毒性、蓄積毒性、遺傳毒性等方面，研究了三者之間的差別，以期揭示千里光的毒性作用及其特點，生物堿含量與毒性之間的量-毒關(guān)系、毒-效關(guān)系以及復(fù)方配伍減毒作用等，為千里光的安全合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。檢測千里光致大鼠肝細胞DN

2、A損傷的方法。選用四種PAs單體化合物IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrotsine對HepG2細胞毒性進行研究，探討GSH對于肝細胞的保護作用，并采用免疫熒光和WESTERN-BLOT等方法，考察細胞小分子蛋白與PAs的毒性關(guān)系，不僅對千里光的全面深入了解發(fā)揮一些作用，而且對于含PAs的其他種屬植物的毒性的預(yù)防和治療，提供參考。
　　 本論文進行了以下幾個方面的研究

3、：
　　 1.急性毒性研究1.1不同產(chǎn)地千里光的總生物堿含量及其急性毒性比較研究為了搞清楚我國主要產(chǎn)區(qū)千里光的PAs含量和比較它們的毒性差異，為臨床和生產(chǎn)中選擇安全性高的藥材提供科學(xué)依據(jù)。比較了全國主要的代表性產(chǎn)區(qū)采集的千里光PAs含量和急性毒性。
　　 結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的千里光毒性有很大的差別，其毒性強弱與千里光總生物堿含量有一定關(guān)系。其中，河南產(chǎn)千里光的生物堿含量最高，毒性也最強，而江蘇、浙江千里光也有一定的毒性，可

4、造成少量動物死亡，但是二者的毒性較河南產(chǎn)千里光的毒性明顯減弱，其PAs含量也相對較低。湖北和廣西產(chǎn)千里光的生物堿含量最低，其毒性也最小。河南產(chǎn)千里光死亡和存活動物肝臟病理學(xué)檢查顯示具有明顯的肝臟毒性作用，主要發(fā)現(xiàn)肝臟中央靜脈擴張淤血、局灶性肝竇輕度擴張淤血、雙核細胞和輕度鈣化灶。結(jié)果提示，在臨床用藥和含千里光的中成藥生產(chǎn)中，應(yīng)該注意產(chǎn)地選擇，選擇PAs含量低，毒性小的千里光入藥，以保證安全性。
　　 1.2千里光及其復(fù)方制劑經(jīng)口

5、用藥急性毒性研究本研究選擇毒性最大的河南千里光，進行了成年小鼠、大鼠以及幼年小鼠的LD50測定，以分析其急性用藥的量-毒關(guān)系，在其安全劑量范圍內(nèi)用藥，可以保證用藥安全，為臨床用藥提供參考。
　　 結(jié)果顯示成年小鼠、幼年小鼠和大鼠一次性灌胃給予千里光水提物，在劑量過高時均顯示出有明顯的毒性和致死性，并有明顯的量-毒關(guān)系。對小鼠與大鼠的量-毒關(guān)系比較，可見大鼠對千里光的耐受較小鼠更強，表明千里光的毒性有一定的種屬差異。成年小鼠一次性

6、灌胃給予千柏鼻炎片水提物（含河南千里光），在劑量過高時顯示出有明顯的毒性和致死性，并有明顯的量-毒關(guān)系，千柏鼻炎片的毒性略低于千里光提取物毒性。
　　 2.千里光及其復(fù)方制劑長期用藥的肝臟毒性研究采用毒性最強的河南產(chǎn)千里光的水提物、千柏鼻炎片及總生物堿部分，以20.0、6.0、3.0、1.5g生藥/kg四個劑量水平（相當(dāng)于臨床劑量的100、30、15、7.5倍）給大鼠連續(xù)灌胃給藥4w，觀察對肝臟的毒性。結(jié)果顯示千里光水提物、總生

7、物堿提取物、千柏鼻炎片分別結(jié)果表明，受試物的20.0g生藥/kg劑量組對凝血指標(biāo)APTT有一定縮短作用，千里光無論是單味藥、總生物堿提取部分還是復(fù)方，對肝臟生化指標(biāo)AST均有一定的影響。組織病理學(xué)顯示三種受試物的20.0g生藥/kg劑量組對大鼠肝臟有輕度毒性反應(yīng)。
　　 3.千里光致毒機理研究3.1千里光致大鼠肝臟細胞DNA損傷的研究采用反復(fù)灌胃給藥4w的千里光水提取物大鼠肝臟，利用彗星試驗檢測千里光提取物對大鼠肝細胞DNA損傷

8、的遺傳終點即DNA斷裂。
　　 結(jié)果顯示千里光3個劑量均能使肝細胞脫尾率及DNA遷移率與對照組相比顯著提高，且肝細胞拖尾率與劑量存在相關(guān)性，說明連續(xù)灌胃30天給予大鼠河南產(chǎn)的千里光能夠?qū)е麓笫蟾渭毎鸇NA斷裂，造成DNA損傷，損傷的頻率隨劑量的增加而增大，故該種千里光可導(dǎo)致肝細胞DNA發(fā)生損傷及影響肝功能。
　　 3.2千里光體內(nèi)致突變作用研究本實驗采用反復(fù)灌胃給藥4w的大鼠股骨骨髓涂片，進行骨髓細胞微核試驗，以確定千里

9、光、千柏鼻炎片和總生物堿致突變作用。結(jié)果顯示三種受試物20.0g生藥/kg劑量下均能顯著升高大鼠骨髓細胞微核率，與對照組比較有非常顯著差異（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明千里光、千柏鼻炎片和總生物堿具有一定的升高骨髓細胞微核率的作用，但是作用較弱。
　　 3.3PAs對HepG2肝細胞毒性研究運用HepG2細胞作模型，研究IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retror

10、sine四種PAs單體化合物的細胞毒性，考察致毒過程中生化指標(biāo)的變化及對肝細胞DNA損傷的影響，預(yù)測含HPAs植物藥的毒性。
　　 結(jié)果顯示：選用的四種PAs單體化合物IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine在各自的高濃度時對細胞皆有高抑制率，明顯抑制細胞活性，Monocrataline、Retrorsine的細胞毒性較強。對生化指標(biāo)測定結(jié)果顯示，當(dāng)細胞受損傷時

11、，細胞內(nèi)的生物活性酶就會大量釋放到上清中，IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocra.taline、Retrorsine能夠明顯影響肝細胞的CK、LDH生物活性酶，增加這兩種活性酶的釋放率；Monocrataline和Retrotsine細胞毒性相對較強，Monocrataline和Retrorsine的適當(dāng)濃度能夠使肝細胞AST、ALT的釋放率增加。說明Monocrataline、Retrorsine比

12、IntegerrimineA、B對肝細胞損傷程度高，對HepG2細胞毒性更強。
　　 單細胞凝膠電泳結(jié)果表明四種PAs單體化合物可引起DNA遷移的變化，拖尾細胞率明顯高于正常細胞。導(dǎo)致DNA段裂，導(dǎo)致細胞壞死和凋亡。
　　 3.4谷胱甘肽對PAs毒性的影響通過檢測PAs致HEPG2細胞毒性GSH的含量變化，研究PAs致毒與GSH相關(guān)性，選用細胞活性抑制率和PAs肝細胞毒性顯著性指標(biāo)ALT，通過生物合成抑制劑丁胱亞磺酰亞胺

13、（BSO）及合成GSH的前提物質(zhì)N-乙酰半胱氨酸（NAC）的作用于HepG2細胞分別抑制和增加細胞內(nèi)GSH的含量，間接探討GSH在PAs所致肝細胞毒性過程中的作用。
　　 結(jié)果顯示：用HepG2細胞探討PAs致肝毒性GSH對其影響，發(fā)現(xiàn)PAs具有明顯的肝細胞毒性，GSH合成抑制劑.BSO可使PAs肝細胞毒性明顯增強，而GSH合成前體物半胱氨酸可使.PAs肝細胞毒性減弱，間接說是GSH對PAs肝細胞毒性具有保護作用。在肝細胞培養(yǎng)液

14、中加入GSH合成前體物半胱氨酸，肝細胞可攝取半胱氨酸并用來合成GSH，4h后，細胞內(nèi)GSH濃度可提高。在肝細胞培養(yǎng)基中加入GSH合成抑制劑BSO，肝細胞不能繼續(xù)合成GSH，原有的GSH經(jīng)過16h的逐漸消耗，肝細胞GSH濃度降低。BSO和半胱氨酸對肝細胞GSH濃度有完全相反的影響，對PAS肝細胞毒性也具有完全相反的作用，因此，可以認為細胞內(nèi)GSH與PAs肝細胞毒性相關(guān)。
　　 3.5PAs對HepG2細胞的小分子蛋白及細胞因子的影

15、響充分利用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫化學(xué)等手段深入研究IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine的細胞毒性，研究其對VEGF、GM130、Cav-1的影響，進一步探討其對肝臟的毒性機制。
　　 結(jié)果顯示：PAs致HepG2細胞毒后VEGF呈現(xiàn)高表達，且IntegerrimineA、Monocrataline、Retrorsine在致HEPG2細胞毒24h時，He

16、pG2表達VEGF呈高峰，IntegerrimineA、Monocmtaline、Retrorsine誘導(dǎo)VEGF具有時間依賴性。HepG2細胞分別經(jīng)四種不同PAs（IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine）作用后經(jīng)免疫熒光標(biāo)記，四種吡咯里西啶生物堿均能降低HepG2胞漿內(nèi)GM130的含量，IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine能