馬齒莧提取物對(duì)小鼠高原肺水腫的預(yù)防作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性高原病(acute mountain disease，AMD)是人體急性暴露于低氧環(huán)境后產(chǎn)生的各種病理性反應(yīng)，是高海拔地區(qū)獨(dú)有的常見(jiàn)病。有報(bào)道稱(chēng)，在快速登上4000米海拔高度的人群中，急性高原病的發(fā)病率可達(dá)到65％。急性高原病主要包括急性高原反應(yīng)(acute mountain sickness，AMS)、急性高原腦水腫(high altitude cerebral edema, HACE)和急性高原肺水腫(

2、high altitude pulmonary edema，HAPE)。后兩種疾病的發(fā)病是建立在急性高原反應(yīng)未得到有效治療，從而發(fā)展為特征明顯、癥狀嚴(yán)重的威脅生命的疾病。HAPE嚴(yán)重威脅登上高海拔的人群健康。急性缺氧時(shí)，機(jī)體內(nèi)神經(jīng)和體液因素使肺動(dòng)脈壓升高，血液成分經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞聚積在肺間質(zhì)內(nèi)。肺泡腔內(nèi)液體的異常聚集，阻礙了肺的換氣功能和氧氣在肺泡內(nèi)的彌散作用，機(jī)體可在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生進(jìn)行性的呼吸困難進(jìn)而造成死亡。已有的調(diào)查資料

3、顯示，HAPE的綜合發(fā)病率為7％～17％，寒冷、低溫以及過(guò)度的體力勞動(dòng)都是HAPE發(fā)病的誘發(fā)因素。然而，雖經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，HAPE的治療仍停留在對(duì)癥治療的狀態(tài)，人們尚不能從根本上治愈HAPE，因此HAPE的預(yù)防研究受到了廣泛的重視。
　　 目前，藥物預(yù)防是國(guó)內(nèi)外普遍采取的預(yù)防HAPE的方法。用于預(yù)防HAPE的藥物包括西藥和中藥兩大類(lèi)，常用的西藥如硝苯地平、沙美特羅和地塞米松等可以通過(guò)拮抗鈣離子通道或激動(dòng)β2受體等途徑擴(kuò)張血管，

4、改善肺組織微循環(huán)，從而在一定程度上預(yù)防高原環(huán)境下HAPE的發(fā)病。但由于這些藥物對(duì)心血管、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的副作用而導(dǎo)致其實(shí)際使用受到很大限制;常用的中藥如銀杏內(nèi)酯、人參皂苷和紅景天等雖然可以提高機(jī)體對(duì)抗缺氧的耐受能力降低HAPE的發(fā)病率，但它們多屬于貴重中藥，資源匱乏并且價(jià)格相對(duì)昂貴，作為預(yù)防HAPE的普及用藥難度很大。因此開(kāi)發(fā)一種預(yù)防效果好、來(lái)源廣泛且副作用低的預(yù)防HAPE的藥物十分必要。
　　 馬齒莧(Portulaca O

5、rleracea L，PO)，為馬齒莧科植物全草，在全世界范圍內(nèi)廣泛分布，是我國(guó)衛(wèi)生部劃定的78種藥食同源的野生植物之一。課題組前期研究表明，馬齒莧提取物（Ethanol extract from Portulaca Oleracea，EEPO）可以延長(zhǎng)小鼠在密閉環(huán)境中的存活時(shí)間，并且在缺氧條件下對(duì)神經(jīng)組織具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。近年來(lái)藥理研究表明，馬齒莧具有抗炎、抗氧化并對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。以上研究提示，EEPO可能具有預(yù)防HAP

6、E的作用。因此，本課題對(duì)EEPO預(yù)防HAPE的作用進(jìn)行了觀察，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 研究目的:
　　 通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察EEPO對(duì)HAPE的預(yù)防作用，并在此基礎(chǔ)上探討EEPO抗HAPE的作用機(jī)制，為將藥食兩用植物馬齒莧開(kāi)發(fā)成預(yù)防HAPE保健食品或藥物提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 一、低壓低氧致HAPE小鼠模型的制作
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　

7、 雄性Bal b/c小鼠70只（購(gòu)自上海西普爾-必凱公司），體重19-24g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機(jī)分為一組對(duì)照組和六組模型組，每組10只。將模型組小鼠分別置于低氧艙中模擬海拔高度5000m(大氣壓53.8kPa)、6000m(大氣壓47.2kPa)和7000m(大氣壓41.2kPa)的氣壓環(huán)境處理3h和6h。模擬暴露結(jié)束后用10％水合氯醛(0.3ml/100gBW)麻醉。取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用PBS溶液經(jīng)肺動(dòng)脈沖洗后，離體肺組織，經(jīng)氣管

8、插入導(dǎo)管，灌入生理鹽水制作支氣管肺泡灌洗液。另取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以0.9％NaCl溶液經(jīng)肺動(dòng)脈灌流后取全肺。取右側(cè)肺組織固定于10％中性甲醛溶液，用于制備切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。左側(cè)肺組織，用濾紙吸干表面水分并立即稱(chēng)取濕重，在80℃烘箱內(nèi)烘烤72h后稱(chēng)取干重。
　　 若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡，則本實(shí)驗(yàn)組將重新進(jìn)行模擬高原缺氧暴露，死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物計(jì)入死亡率。
　　 2、死亡率的計(jì)算
　　 死亡率=死亡小鼠（只）/接

9、受模擬高原缺氧暴露小鼠（只）*100％
　　 3、小鼠肺組織干濕重測(cè)定
　　 小鼠肺干濕重比=肺濕重(g)/肺干重(g)*100％
　　 4、小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度的測(cè)定
　　 用BCA法測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度。選擇商業(yè)化的BCA試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)所提供的方法進(jìn)行操作。
　　 5、小鼠肺組織病理檢查
　　 肺組織HE染色:動(dòng)物肺經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后切

10、片、烤片、蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。
　　 二、EEPO預(yù)防小鼠HAPE的藥效觀察
　　 1、EEPO及陽(yáng)性對(duì)照藥人參皂苷的制備
　　 EEPO由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科提供，溶于0.9％生理鹽水中，配成低、中、高劑量的溶液，折合成生藥量分別為2g/ml、4g/ml、8g/ml。
　　 人參皂苷，由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科提供，溶于0.9％生理鹽水中，折合成生藥量為8g/m

11、l的溶液。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　 雄性Bal b/c小鼠（購(gòu)自上海西普爾-必凱公司）90只，體重(19～24)g。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、HAPE模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥人參皂苷組(8g/ml)、EEPO低(2g/ml)、中(4g/ml)、高(8g/ml)劑量給藥組，每組15只。
　　 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于每天上午九點(diǎn)按EEPO溶液2.5ml/100g動(dòng)物體重，對(duì)低、中和高劑量三個(gè)劑量組灌胃對(duì)

12、應(yīng)濃度EEPO溶液。陽(yáng)性對(duì)照藥組按照人參皂苷2.5ml/100g動(dòng)物體重灌胃，HAPE模型組和空白對(duì)照組按照2.5ml/100g動(dòng)物體重灌胃生理鹽水?？诜o藥前稱(chēng)動(dòng)物體重以調(diào)整灌胃體積，連續(xù)灌胃7天。標(biāo)本采集同第一部分。余下肺組織分裝放入凍存管，置-80℃低溫冰箱保存。另外，在模擬高原缺氧暴露結(jié)束前半小時(shí)，取5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物向其體內(nèi)注射2％的依文思藍(lán)溶液，暴露結(jié)束后測(cè)定肺組織內(nèi)依文思藍(lán)含量。
　　 3、小鼠肺組織干濕重測(cè)定
　

13、　 方法同第一部分。
　　 4、小鼠BALF蛋白含量測(cè)定
　　 方法同第一部分。
　　 5、小鼠肺組織毛細(xì)血管通透性測(cè)定
　　 結(jié)果表示為吸光度(OD)/肺干重(g)
　　 6、小鼠肺組織病理檢查
　　 肺組織HE染色方法同第一部分。
　　 三、EEPO預(yù)防HAPE作用的機(jī)制探討
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理同第二部分。
　　 2

14、、小鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平的測(cè)定。
　　 氧化應(yīng)激測(cè)定試劑盒購(gòu)自試劑公司（碧云天，中國(guó)）。實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)肺組織中的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)和超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase，SOD)進(jìn)行檢測(cè)，明確氧化產(chǎn)物和抗氧化物在肺組織中的含量。操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)所提供的步驟進(jìn)行。
　　 3、小鼠肺組織中NF-kB通路(I

15、KK，p65)蛋白含量測(cè)定
　　 選用商品化的細(xì)胞核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（南京凱基，中國(guó)）從小鼠肺組織勻漿中分離胞漿蛋白與核蛋白。然后用Western Blot法測(cè)定胞漿中IKB激酶(IKBkinase，IKK)和細(xì)胞核中p65蛋白的表達(dá)量。
　　 4、小鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、P-selectin、E-selectin、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)量測(cè)定
　　 采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR法

16、(Real-time PCR)測(cè)定小鼠肺組織內(nèi)白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、P-選擇素(P-selectin)、E-選擇素(E-selectin)、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-1

17、，VCAM-1)mRNA的表達(dá)水平。
　　 5、小鼠肺組織IL-1β和TNF-α濃度的測(cè)定
　　 選用商業(yè)化的ELISA試劑盒（欣博盛，中國(guó)）對(duì)肺組織勻漿中IL-1β和TNF-α濃度進(jìn)行測(cè)定。
　　 6、小鼠肺組織選擇素(P-selectin，E-selectin)和粘附分子(ICAM-1,VCAM-1)蛋白含量的測(cè)定
　　 采用Western Blot法測(cè)定小鼠肺組織P-選擇素、E-選擇素、ICAM-1

18、和VCAM-1蛋白的表達(dá)水平。
　　 四、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn);病理檢查采用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、小鼠急性高原缺氧條件摸索
　　 1、小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的死亡率
　

19、　 暴露條件為5000米3小時(shí)，6000米3小時(shí)組均無(wú)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡;7000米3小時(shí)組有10％實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死于艙內(nèi);5000米6小時(shí)組、6000米6小時(shí)組和7000米6小時(shí)組的死亡率分別是15％、35.5％和46.7％。
　　 2、肺組織干濕重
　　 模型組5000米3小時(shí)組與6000米3小時(shí)組與空白對(duì)照組小鼠干濕重相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);7000m3h、5000m6h、6000m6h和7000m6h組肺組織干

20、濕重與對(duì)照小鼠相比有顯著差異(p＜0.01)。
　　 3、小鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度
　　 模型組5000米3小時(shí)組與空白對(duì)照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.80);6000米3小時(shí)組與對(duì)照組小鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);7000米3小時(shí)、5000米6小時(shí)、6000米6小時(shí)和7000米6小時(shí)組支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度與對(duì)照小鼠相比有不同程度的升高(p＜0.01)。
　　

21、4、小鼠肺組織病理檢查
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。結(jié)果顯示，5000米、6000米和7000米缺氧暴露6小時(shí)后可見(jiàn)較為明顯肺損傷。表現(xiàn)為肺泡內(nèi)有較為明顯的水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺出血。
　　 二、EEPO預(yù)防小鼠高原肺水腫的藥效觀察
　　 1、肺干濕重
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HAPE模型組小鼠肺組織干濕重與空白對(duì)照組相比明顯升高(p＜0.05)，低劑量EEPO組與模型組相比沒(méi)有統(tǒng)

22、計(jì)學(xué)差異，中、高劑量EEPO組均不同程度地減輕低壓低氧暴露所導(dǎo)致的肺干濕重上升(p＜0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺組織干濕重較HAPE模型組也有一定程度的降低(p＜0.05)。
　　 2、BALF中蛋白質(zhì)濃度
　　 HAPE模型組小鼠肺泡灌洗液中總蛋白質(zhì)濃度較對(duì)照組濃度明顯升高(p＜0.05)，預(yù)防性給予低劑量EEPO后，支氣管肺泡灌洗液蛋白質(zhì)濃度與缺氧模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中、高劑量的EEPO，能夠明顯降低模擬高原缺氧環(huán)境

23、下支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度(p＜0.05)，并且EEPO各組之間呈一定的劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。人參皂苷組小鼠支氣管肺泡灌洗液中總蛋白質(zhì)濃度較模型組有顯著降低(p＜0.05)，但與低、中劑量EEPO組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、肺毛細(xì)血管通透性
　　 HAPE模型組與對(duì)照組相比小鼠肺組織毛細(xì)血管通透性顯著升高(p＜0.05)，預(yù)防性給予中、高劑量EEPO可不同程度地降低毛細(xì)血管通透性(p＜0.05)。人參皂苷組小鼠肺毛細(xì)血管通透性

24、較模型組相比也有一定程度的降低(p＜0.05)，但其與低、中劑量EEPO組在保護(hù)小鼠肺毛細(xì)血管通透性方面未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　 4、小鼠肺組織病理
　　 光鏡下發(fā)現(xiàn)HAPE模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷，在預(yù)防性給予EEPO和人參皂苷可以在不同程度上減輕肺水腫，降低炎癥反應(yīng)和氣血屏障損傷。主要表現(xiàn)為血管通透性降低和肺內(nèi)出血的減少。
　　 三、EEPO預(yù)防小鼠高原肺水腫的作用的機(jī)制探討

25、　　 1、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響
　　 HAPE模型組小鼠MDA相比較空白對(duì)照組有明顯升高(p＜0.01)，與此同時(shí)具有抗氧化作用的GSH和SOD水平也出現(xiàn)顯著的降低(p＜0.05)。預(yù)防性給予EEPO后可以不同程度地減輕MDA升高幅度，提高GSH和SOD的濃度(p＜0.05)。人參皂苷組也呈現(xiàn)出上述變化，在減輕低壓低氧暴露所導(dǎo)致MDA濃度升高的同時(shí)，提高機(jī)體抗氧化物質(zhì)GSH和SOD的濃度。
　　

26、 2、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織NF-kB通路IKK和p65蛋白表達(dá)的影響
　　 HAPE模型組肺組織細(xì)胞質(zhì)中IKK和細(xì)胞核p65表達(dá)量與正常對(duì)照組相比均明顯增加(p＜0.05)。給予EEPO可不同程度地下調(diào)HAPE小鼠肺組織細(xì)胞質(zhì)中IKK和細(xì)胞核p65表達(dá)量(p＜0.05)，且改變呈劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。
　　 3、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的影響
　　 HAP

27、E模型組小鼠肺組織中IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組增加(p＜0.01)。給予不同劑量EEPO進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)可不同程度地下調(diào)HAPE小鼠肺組織中IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá)(p＜0.05)。中劑量EEPO與陽(yáng)性對(duì)照藥組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織中選擇素(P-selectin，E-selectin) mRNA表達(dá)的影響
　　 與空白對(duì)照組相比，HAPE模型組小鼠

28、肺組織中P-selectin和E-selectin的mRNA表達(dá)量均明顯增加(p＜0.01).預(yù)防性給予EEPO可明顯下調(diào)低壓低氧暴露小鼠肺組織中P-selectin和E-selectin mRNA表達(dá)，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 5、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織中粘附分子(ICAM-1、VCAM-1) mRNA表達(dá)量的影響
　　 ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)量在HAPE模型組中相比空白對(duì)照組有明顯增

29、加(p＜0.01)。給予EEPO干預(yù)可不同程度減輕ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)。陽(yáng)性藥物也可以降低二者mRNA表達(dá)，其作用優(yōu)于低劑量EEPO組。
　　 6、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)的影響
　　 正常小鼠肺組織中IL-1β和TNF-α濃度較低，在HAPE模型小鼠中可見(jiàn)IL-1β和TNF-α有明顯的升高(p＜0.05)。不同劑量的EEPO可改善低壓低氧環(huán)境下肺組織I

30、L-1β和TNF-α的濃度(p＜0.05)，且IL-1β和TNF-α的濃度隨著EEPO濃度的升高而下降。人參皂苷組與HAPE模型組相比，肺勻漿中的IL-1β和TNF-α蛋白也降低(p＜0.05)。
　　 7、EEPO對(duì)HAPE小鼠肺組織中P-selectin，E-selectin，ICAM-1，和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響
　　 正常小鼠肺組織中選擇素和粘附分子蛋白表達(dá)較低，在HAPE模型小鼠中可見(jiàn)選擇素和粘附分子蛋白表

31、達(dá)有明顯的升高(p＜0.05)。不同劑量的EEPO可改善HAPE小鼠肺組織炎癥過(guò)程中的選擇素和粘附分子蛋白表達(dá)，且高劑量EEPO較低劑量EEPO更具有抑制選擇素和粘附分子蛋白表達(dá)的作用。人參皂苷組與HAPE模型組相比，肺組織選擇素和粘附分子蛋白表達(dá)量也有所降低(p＜0.05)，其蛋白表達(dá)水平與中劑量EEPO所致的選擇素和粘附分子表達(dá)水平相當(dāng)。
　　 結(jié)論:
　　 1、在模擬不同海拔高度和不同暴露時(shí)間對(duì)小鼠肺組織的損傷時(shí)發(fā)

32、現(xiàn)在模擬海拔6000米和7000米缺氧暴露6小時(shí)的條件下，小鼠肺損傷的病理變化較為明顯。肺水腫和支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度也提示了顯著的肺損傷。綜合考慮造模過(guò)程中小鼠死亡率的情況，確定在后續(xù)的藥效和機(jī)制研究中均采用海拔6000米暴露6小時(shí)這一條件進(jìn)行研究;
　　 2、EEPO可減輕HAPE小鼠肺組織含水量、支氣管肺泡灌洗液中總蛋白的濃度以及肺毛細(xì)血管在低壓低氧條件下的通透性。這表明EEPO具有較好的預(yù)防低壓低氧暴露對(duì)肺的損傷作用

33、;
　　 3、在預(yù)防性給予EEPO干預(yù)后小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平相比于HAPE模型組來(lái)講有明顯的降低，抑制了NF-kB通路的激活。這樣就使得由NF-kB通路介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子、選擇素和粘附分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，蛋白表達(dá)降低。因此，減輕了肺組織中炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)了內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管壁的完整性，達(dá)到預(yù)防HAPE發(fā)生的目的;
　　 4、EEPO雖然能夠抑制NF-kB通路的激活，但EEPO對(duì)HAPE保護(hù)作用的機(jī)制仍需要進(jìn)一步