牦牛幾種腹瀉相關(guān)因素研究及其呼吸道疾病血清學(xué)調(diào)查.pdf

1、牦牛因?qū)η嗖馗咴貛?yán)寒、缺氧、缺草等惡劣條件具有良好的適應(yīng)能力而成為高寒牧區(qū)最重要的生產(chǎn)生活資料，其生態(tài)、社會、經(jīng)濟(jì)地位不可替代。但由于農(nóng)牧民粗放的掠奪式經(jīng)營管理，牦牛嚴(yán)重的近親繁殖，致使草場退化，沙化嚴(yán)重，畜群結(jié)構(gòu)不合理以及牦牛品種退化，所以近年來牦牛尤其是犢牦牛各種疾病的發(fā)病率逐年升高。犢牦牛腹瀉是臨床上最為常見的多發(fā)病，也是影響犢牦牛繁活率的主要因素之一。引起犢牦牛腹瀉的因素比較復(fù)雜，主要與犢牦牛生理功能、營養(yǎng)、應(yīng)激、及病原微生

2、物的侵襲等有關(guān)。該病的發(fā)生嚴(yán)重影響著犢牦牛的生長發(fā)育以及成年后的生產(chǎn)性能，給高原地區(qū)牦牛養(yǎng)殖業(yè)造成了不容忽視的經(jīng)濟(jì)損失。故本實(shí)驗(yàn)主要在微量元素及犢牦牛腸道菌群與腹瀉的關(guān)系、引起犢牦牛腹瀉的主要病原及牦牛主要呼吸道疾病血清流行病學(xué)等方面展開研究和調(diào)查，并取得如下結(jié)果:
　　1.牦牛腹瀉與微量元素銅、鐵、鋅、硒、錳關(guān)系的研究
　　選擇10頭健康牦牛和25頭腹瀉牦牛，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定每頭牦牛血清中Cu

3、、Fe、Mn、Zn、Se微量元素含量。比較健康組和腹瀉組牦牛血清中Cu、Fe、Mn、Zn、Se元素含量的水平;比較牦牛腹瀉組不同年齡階段血清中Cu、Fe、Mn、Zn、Se元素含量的水平。結(jié)果腹瀉組Fe、Mn、Zn水平均顯著低于健康對照組，Cu水平顯著高于健康對照組，Se水平差異不顯著;腹瀉組中≤1月齡牦牛血清中Zn，Mn元素水平顯著高于≥2年齡牦牛，Cu、Fe、Se含量不顯著。腹瀉牦牛血清Fe、Mn、Zn微量元素水平偏低，且與年齡有相關(guān)

4、性。
　　2.腹瀉犢牦牛與健康犢牦牛腸道菌群的差異研究
　　本試驗(yàn)以健康犢牦牛和腹瀉犢牦牛新鮮糞樣為研究對象，通過對細(xì)菌16S rDNAV3-V4區(qū)高通量測序比較了腹瀉犢牦牛和健康犢牦牛腸道菌群數(shù)量差異及菌群結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果共獲得了272071條優(yōu)化序列，經(jīng)鑒定細(xì)菌來源9個門，13個綱，17個目，36個科，72個屬。腹瀉犢牦牛腸道菌群的菌種數(shù)目低于健康組，但多樣性比較沒有顯著性差異;但兩組菌群結(jié)構(gòu)比較，在門、綱、目、科及屬水平

5、上皆有顯著性。本研究表明犢牦牛腹瀉與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變存在一定的相關(guān)性。
　　3.牦牛源大腸桿菌的分離鑒定及其相關(guān)毒力基因檢測
　　本研究于2014年6月到8月從紅原地區(qū)無菌采集50頭臨床腹瀉犢牦牛肛拭子，對其分離純化培養(yǎng)、生化鑒定，并對大腸桿菌分離株進(jìn)行O血清型測定、小鼠致病性實(shí)驗(yàn)、16SrRNA測序及毒力基因檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)共鑒定出47株大腸桿菌;通過玻片凝集鑒定出12種O血清型，覆蓋37株分離株

6、，另有10株未定型，其優(yōu)勢血清為O125、O145和O91;分離菌株腹腔注射小鼠均致病，剖檢可見明顯病變;隨機(jī)挑選12株分離株進(jìn)行16SrRNA測序，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)分離菌株組內(nèi)同源性為99.7％～100％，與Genbank中其他菌株的同源性為94％～98％;通過PCR方法檢測犢牦牛源大腸桿菌毒力基因，其中iss、fimH、OmpA、papC、traTa、tsh、iucD和ETT2在犢牦牛源大腸桿菌的檢出率分別為65.2％、21.7％

7、、91.3％、34.8％、8.7％、34.8％、30.4％、65.2％, KspⅡ、cva均為4.3％, STa、irp2均未檢出。表明，犢牦牛源大腸桿菌血清型比較復(fù)雜，并攜帶多種毒力基因。
　　4.犢牦牛源致病性大腸桿菌全基因組測序分析
　　本實(shí)驗(yàn)測序結(jié)果原始數(shù)據(jù)為6.92 G，過濾數(shù)據(jù)后數(shù)據(jù)量為6.89 G，測序深度分別為1384X和1378 X，測序質(zhì)量滿足后續(xù)分析要求;使用velvet進(jìn)行不同kmer的基因組組裝，最

8、優(yōu)組裝結(jié)果的contig n50為52203 bp，使用SSPACE_ Standard進(jìn)一步構(gòu)建scaffold以及GapCloser局部組裝補(bǔ)洞之后得到的contig和scaffold的n50達(dá)到了130308 bp和354007 bp，最后得到的基因組大小為5.3 M，預(yù)測的基因模型為5438個，數(shù)量級上符合大腸桿菌全基因組5M左右的背景預(yù)期。以大腸桿菌參考基因組序列(NCBI下載的完成圖)為依據(jù)，使用Mauve Contig M

9、over軟件對velvet組裝的scaffold進(jìn)行定位，得到每條scaffold之間的order信息之后，使用200個n將scaffold連接成一條完整的線性染色體。并對線性染色體進(jìn)行基因預(yù)測，找到了5543個蛋白編碼基因，10個rRNA和92個tRNA，接著對大腸桿菌基因組進(jìn)行了重復(fù)序列、基因島、前噬菌體預(yù)測，并對蛋白編碼基因進(jìn)行了NR、Swiss-prot、COG、KEGG、GO功能注釋。
　　5.牦牛主要呼吸道疾病的血清學(xué)

10、調(diào)查
　　應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對在2011年間采自西藏的938份和青海的206份共1144份牦牛血清進(jìn)行結(jié)核桿菌抗體檢測，同時對采自西藏988份、青海475份和四川377份共1840份牦牛血清進(jìn)行牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體檢測。結(jié)果檢出結(jié)核桿菌陽性血清樣品西藏陽性率2.56％，青海陽性率0.98％;檢出牛傳染性鼻氣管炎陽性血清樣品西藏陽性率38.6％;青海陽性率44.6％及四川陽性率27.9％。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明牛結(jié)核桿菌和