細(xì)基格孢屬(Ulocladium)分子系統(tǒng)學(xué)及有性進(jìn)化趨勢(shì)研究.pdf

1、有性生殖是真菌的重要繁衍方式，可以使生物體發(fā)生遺傳物質(zhì)重組，增加基因漂變頻率，增強(qiáng)對(duì)環(huán)境壓力的選擇性和適應(yīng)性，在漫長的進(jìn)化歷程中具有顯著優(yōu)勢(shì)。然而細(xì)基格孢屬作為絲狀子囊真菌的一個(gè)重要類群，其有性發(fā)育階段一直未被發(fā)現(xiàn)，而且有關(guān)該屬有性進(jìn)化及發(fā)育的研究資料積累甚少。交配型(MAT)基因是真菌有性生殖過程中的重要調(diào)控因子，因此對(duì)MAT基因的研究有助于解釋細(xì)基格孢屬缺乏有性態(tài)的原因。本研究基于對(duì)MAT基因的系統(tǒng)學(xué)及分子遺傳學(xué)分析，對(duì)細(xì)基格孢屬有

2、性進(jìn)化趨勢(shì)進(jìn)行了初步探索，主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)本研究擴(kuò)增得到了細(xì)基格孢屬26個(gè)典型種的MAT1-1-1和MAT1-2-1基因全長，并發(fā)現(xiàn)在所有參試菌株中，兩個(gè)MAT基因均同時(shí)存在，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與同宗配合真菌類似。而且RT-PCR結(jié)果表明，MAT1-1-1和MAT1-2-1基因在細(xì)基格孢屬中均能夠正常表達(dá)。因此，我們推測(cè)細(xì)基格孢屬具有有性發(fā)育的潛力，而且不能排除該屬偶爾或小范圍發(fā)生有性生殖的可能性。然后，通過Tail-PC

3、R繼續(xù)擴(kuò)增得到了葡串細(xì)基格孢的MAT1-1和MAT1-2完整等位點(diǎn)及其側(cè)翼序列。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，葡串細(xì)基格孢M(jìn)AT等位點(diǎn)長度均大于幾個(gè)近似屬，且兩個(gè)等位點(diǎn)都只含有一個(gè)基因，分別為MAT1-1-1和MAT1-2-1。MAT1-1ORF包含一個(gè)完整的alpha-box結(jié)合域，MAT1-2ORF包含一個(gè)完整的HMG-box結(jié)合域。在葡串細(xì)基格孢M(jìn)AT1-1和MA T1-2等位點(diǎn)的5'側(cè)翼序列上，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)保守的ORF1，是釀酒酵母中假定蛋白(

4、YLR456W)的同系物。在不同物種中ORF1的序列和長度都很保守，但ORF1與MAT等位點(diǎn)5'端的距離差異較大。
　　(2)為了有效評(píng)估MAT基因在細(xì)基格孢屬不同種間系統(tǒng)發(fā)育分析中的適用性，本研究利用Templeton、Winning-sites和Kishino-Hasegawa等檢測(cè)方法，對(duì)MAT進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與GAPDH和Alta1基因加和樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果P值均小于0.0001，說明了MAT進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與加和

5、樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異，MAT基因并不適合用于細(xì)基格孢屬內(nèi)種間的系統(tǒng)發(fā)育分析。這可能是頻繁的基因滲入和基因橫向遷移引起的，相比較基因組中其它區(qū)域，性別調(diào)控基因在真菌不同物種間的基因漂移更頻繁。另外，細(xì)基格孢屬M(fèi)AT1-1-1和MAT1-2-1進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)間也存在顯著差異。該結(jié)果表明，細(xì)基格孢屬中的兩個(gè)MAT基因起源于不同的進(jìn)化事件，這可能是該屬一直未發(fā)現(xiàn)有性繁殖階段的原因之一。為了驗(yàn)證細(xì)基格孢屬M(fèi)AT基因是否適合用于屬間

6、系統(tǒng)學(xué)分析，本研究用最大簡約法和貝葉斯法構(gòu)建了格孢腔菌科中四個(gè)近似屬(Ulocladium、Alternaria、Cochliobolus和Pleospora)的進(jìn)化樹，結(jié)果很好地反映了四個(gè)近似屬間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，說明了MAT基因適用于細(xì)基格孢屬及其近似屬間的系統(tǒng)學(xué)分析。細(xì)基格孢屬交配型基因的系統(tǒng)學(xué)研究對(duì)分析屬內(nèi)及屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，揭示絲狀真菌的有性生殖起源及性染色體進(jìn)化具有重要的作用，而且對(duì)于其他高等動(dòng)植物的相關(guān)研究有著重要的參考價(jià)值

7、。
　　(3)本研究以不同環(huán)境條件處理后的細(xì)基格孢菌株為材料，利用qRT-PCR檢測(cè)Actin、β-tubulin、EF-1α、GAPDH、RL13、TBP和UBC等7個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)量，并用geNorm軟件對(duì)不同內(nèi)參基因的表達(dá)量變化進(jìn)行比較分析，篩選出了不同環(huán)境條件下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果分析表明，沒有一個(gè)內(nèi)參基因在所有條件下都能夠穩(wěn)定表達(dá)，7個(gè)基因在不同溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基質(zhì)、光照周期和CO2濃度下的表達(dá)穩(wěn)定度分別為:A

8、ctin＞EF-1α＞GAPDH＞ UBC＞TBP＞β-tubulin＞RL13; TBP＞EF-1α＞β-tubulin＞Actin＞GAPDH＞UBC＞RL13; EF-1α＞TBP＞GAPDH＞β-tubulin＞UBC＞RL13＞Actin; GAPDH＞EF-1α＞Actin＞TBP＞β-tubulin＞UBC＞RL13GAPDH＞EF-1α＞Actin＞ TBP＞β-tubulin＞UBC＞RL13。另外，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)中所需

9、的最佳內(nèi)參基因數(shù)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，在不同溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基質(zhì)下選擇4個(gè)內(nèi)參基因，不同光照因子下選擇2個(gè)內(nèi)參基因，不同CO2濃度下選擇3個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正即可獲得可靠的結(jié)果。以上研究結(jié)果為開展細(xì)基格孢屬功能基因的表達(dá)分析奠定了基礎(chǔ)，并為其它絲狀子囊真菌內(nèi)參基因的選擇提供了參考依據(jù)。
　　(4)MAT基因表達(dá)量的高低直接影響了真菌有性態(tài)的產(chǎn)生，為了找到細(xì)基格孢屬產(chǎn)生有性態(tài)的適宜環(huán)境條件，本研究選取該屬典型種U.alterna

10、riae及U.arborescens為參試菌，并以Pleosporatarda的有性態(tài)為參比，經(jīng)不同環(huán)境因子誘導(dǎo)處理后，利用qRT-PCR檢測(cè)MAT1-1-1和MAT1-2-1基因轉(zhuǎn)錄水平，界定了適宜典型種菌不同交配型基因高效表達(dá)的環(huán)境條件。結(jié)果分析表明，經(jīng)溫度5-10℃，HAY培養(yǎng)基及光照黑暗交替誘導(dǎo)處理后，兩典型種菌的交配型基因呈明顯上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，說明溫度、培養(yǎng)基質(zhì)和光照等是影響細(xì)基格孢有性發(fā)育的重要環(huán)境因子。雖然適宜的環(huán)境因子利于

11、典型種菌MAT基因上調(diào)表達(dá)，但經(jīng)反復(fù)誘導(dǎo)處理后，均未產(chǎn)生有性發(fā)育特征。說明了環(huán)境因子雖然有利于無性真菌有性態(tài)的產(chǎn)生，但僅對(duì)遺傳因子起輔助調(diào)控作用，單獨(dú)依靠環(huán)境因子很難誘導(dǎo)其產(chǎn)生有性態(tài)。另外，在各種環(huán)境因子誘導(dǎo)下，MAT1-1-1和MAT1-2-1兩個(gè)基因呈現(xiàn)出相同的表達(dá)趨勢(shì)，說明在細(xì)基格孢屬的有性進(jìn)化過程中，兩個(gè)MAT基因發(fā)揮著同等重要的調(diào)控作用。而且，在不同培養(yǎng)條件下，參比有性種Pleospora tarda中MAT基因的表達(dá)量均明顯

12、高于無性種U.alternariae和U.arborescens中的表達(dá)量，甚至高出幾十倍。說明了MAT基因的高效表達(dá)有利于無性絲孢真菌產(chǎn)生有性態(tài)，MAT基因表達(dá)量低可能是細(xì)基格孢屬不易產(chǎn)生有性態(tài)的重要原因之一。
　　(5)本研究利用根癌農(nóng)桿菌菌株AGL-1，分別以葡串細(xì)基格孢和異旋孢腔菌突變菌株C4-41.7為受體菌，對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡串細(xì)基格孢和C4-41.7菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)

13、果得出，在細(xì)基格孢的轉(zhuǎn)化過程中，用200μmol/L AS處理，28℃共培養(yǎng)36h，農(nóng)桿菌OD600為0.8，受體孢子濃度為1×106個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高;在C4-41.7菌株的轉(zhuǎn)化過程中，200μmol/L AS處理，25℃共培養(yǎng)48h，農(nóng)桿菌OD600為0.8，受體孢子濃度為1×105個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究MAT基因功能打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)其他絲狀子囊真菌的遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的借鑒作用。
　　(6)為了

14、進(jìn)一步探究細(xì)基格孢屬中MAT基因功能，闡明絲狀子囊真菌有性生殖模式的分子機(jī)制和遺傳基礎(chǔ)，本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，對(duì)葡串細(xì)基格孢和異旋孢腔菌的MAT基因進(jìn)行了異源表達(dá)。研究結(jié)果表明，葡串細(xì)基格孢M(jìn)AT1-1-1和MAT1-2-1基因在異旋孢腔菌的遺傳背景中具有功能，可以調(diào)控異旋孢腔菌產(chǎn)生有性態(tài);而且在不同真菌物種中，MAT基因的功能是可以互換的;分子結(jié)構(gòu)相似的MAT基因在交配過程中的功能也相同;異旋孢腔菌的生殖模式是由MA