紅茶和綠茶多酚與豬胰腺α-淀粉酶相互作用的酶催化動(dòng)力學(xué)和熒光猝滅研究.pdf

1、目的：本研究旨在以豬胰腺α-淀粉酶(porcine pancreaticα-amylase，PPA)作為人唾液α-淀粉酶(human salivaryα-amylases，HSA)的蛋白質(zhì)模型，通過(guò)酶的動(dòng)力學(xué)和熒光猝滅實(shí)驗(yàn)，從分子水平考察紅/綠茶茶多酚(tea polyphenols，TP)抑制PPA催化水解淀粉的效果和特異性，以及對(duì)PPA蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光的猝滅效果，從而為解釋紅/綠茶TP對(duì)口腔感覺(jué)的收斂性作用和酶抑制類型的生理意義奠定

2、理論基礎(chǔ)。 方法：在不間斷540nm波長(zhǎng)下，測(cè)量PPA催化生成的麥芽糖的吸光度增加值，通過(guò)動(dòng)力曲線的直線段的斜率獲得反應(yīng)速度，由Lineweaver-Burk圖求出動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Vmax和Ks)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析確定抑制類型。滴加不同濃度的紅/綠茶TP溶液，以295nm波長(zhǎng)(λex)檢測(cè)PPA的熒光強(qiáng)度，通過(guò)獲得的熒光光譜計(jì)算Stern-Volmer猝滅常數(shù)(Ksv)、雙分子猝滅常數(shù)(kq)、表觀靜態(tài)猝滅常數(shù)(Kapp)、動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(

3、KD)和靜態(tài)猝滅常數(shù)(KS)。 結(jié)果：無(wú)抑制劑和紅茶抑制劑的最大反應(yīng)速度(Vmax)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無(wú)抑制劑和綠茶抑制劑的酶-底物解離常數(shù)(Ks)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。紅茶抑制劑解離常數(shù)(Ki)值高于綠茶(P<0.05)。同一品牌TP的動(dòng)、靜態(tài)猝滅常數(shù)(KD與Ks)之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙分子猝滅常數(shù)(kq)大于雙分子擴(kuò)散限制性猝滅常數(shù)值(1×1040M-1s-1

4、)，伴隨紅/綠茶TP溶液濃度增加，熒光發(fā)射波長(zhǎng)(λem)發(fā)生紅移。紅/綠茶多酚與PPA在Trp59上存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(n=1)。紅/綠茶猝滅劑對(duì)PPA熒光猝滅的距離作用的K存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，紅茶的表觀猝滅常數(shù)大于綠茶(P<0.05)。 結(jié)論：紅茶TP對(duì)PPA的抑制為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制型，綠茶TP對(duì)PPA的抑制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制型。紅茶抑制劑既能與自由酶的活化中心位點(diǎn)結(jié)合，也能與酶-底物上的位點(diǎn)結(jié)合，而綠茶抑制劑僅能與活化中心位