大豆ERECTA響應(yīng)蔭蔽脅迫的機(jī)理研究.pdf

1、玉米大豆帶狀套作種植模式是在傳統(tǒng)的間套作基礎(chǔ)上發(fā)展出的新的種植模式，保障了玉米和大豆的產(chǎn)量，提高了土地當(dāng)量比。但是，高位作物玉米形成了蔭蔽環(huán)境，光質(zhì)和光強(qiáng)發(fā)生了劇烈的變化。大豆幼苗的生長受到蔭蔽環(huán)境的影響，植株出現(xiàn)避蔭反應(yīng)綜合征，最終導(dǎo)致大豆產(chǎn)量降低。因此，探究大豆避蔭反應(yīng)的分子機(jī)理具有重要意義。ERECTA是一個編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的植物類受體激酶。研究表明:擬南芥中的ERECTA參與避蔭反應(yīng)。但是，大豆的ERECTA蔭蔽脅迫下表達(dá)

2、調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究從大豆ERECTA入手，從分子水平上闡釋大豆ERECTA同源基因（GmERs）在避蔭反應(yīng)中的表達(dá)調(diào)控機(jī)理。
　　本研究選用對蔭蔽敏感的南032-4（由地方品種“忠縣十月黃”經(jīng)60Coγ射線輻射后產(chǎn)生的變異后代）和擬南芥野生型Col-0及ERECTA(AtER)基因的缺失突變體(er)作為實(shí)驗(yàn)材料，開展植物響應(yīng)蔭蔽脅迫的分子機(jī)理研究，研究結(jié)果如下:
　　1.在綠膜模擬的蔭蔽環(huán)境下，南032-4和擬南芥C

3、ol-0、er突變體的表型均出現(xiàn)了相似的避蔭反應(yīng)綜合征:南032-4表現(xiàn)出下胚軸、株高、節(jié)間增長，莖干變細(xì)，葉面積減小的表型;擬南芥Col-0和er突變體也出現(xiàn)下胚軸、葉柄伸長，葉面積減小的表型，但是er突變體對蔭蔽環(huán)境不敏感?？梢?，大豆和擬南芥采用相似的避蔭策略來適應(yīng)蔭蔽環(huán)境。其中，下胚軸的長度可以作為大豆和擬南芥產(chǎn)生避蔭反應(yīng)的一個重要參數(shù)。
　　2.蔭蔽環(huán)境下，南032-4葉片光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均顯著

4、降低。可見，蔭蔽脅迫降低了南032-4的光合作用強(qiáng)度。
　　3.通過在數(shù)據(jù)庫中對GmERs的檢索和序列比對發(fā)現(xiàn)GmERs有4個，分別是GmERa(Glyma04g05912),GmERb(Glyma06g05900),GmERc(Glyma14g11220)和GmERd(Glyma17g34380)，它們與擬南芥中的AtER基因序列高度相似，且分為了兩支。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，GmERs的表達(dá)具有組織特異性。它們在南032-4

5、地上分生組織中均有較高的表達(dá)量。
　　4.通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與正常光照相比，在蔭蔽脅迫下，GmERs表達(dá)量均有升高，且GmERs在不同組織中表達(dá)有差異。同時，在蔭蔽脅迫下，擬南芥Col-0中AtER表達(dá)量也顯著升高。這表明GmERs和AtER均參與避蔭反應(yīng)。
　　5.通過Gateway克隆GmERa的CDS序列以及GmERa，GmERb，GmERc和GmERd的啟動子（GmERap，GmERbp，GmERcp，GmE

6、Rdp）。成功構(gòu)建為pBASTA-35S-GmERa-GFP,pBA STA-GmER ap-G US,pBASTA-GmERbp-GUS,pBASTA-GmERcp-GUS，pBASTA-GmERdp-GUS。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，浸染擬南芥Col-0和er，通過噴施Basta和RT-PCR鑒定得到轉(zhuǎn)基因植株。
　　6.含GmERa的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株可以恢復(fù)er的表型:葉面積和葉柄長度均大于野生型Col-0。結(jié)果表明:

7、蔭蔽脅迫下，GmERa的轉(zhuǎn)基因植株的下胚軸顯著伸長。
　　7.蔭蔽脅迫下，擬南芥er phyb雙突純合體下胚軸顯著伸長，但比phyb單突短。不同濃度的赤霉素:Gibberellin(GA3:0.5μM、1μM、2μM和5μM)、生長素類似物:Picloram（PIC:0.5μM、1μM、2μM和5μM）、乙烯前體:Aminocyclopropanecarboxylic Acid(ACC:0.01μM、0.1μM、1μM和10μM)

8、、表油菜素內(nèi)酯:Brassinosteroids（24-epiBL:0.01μM、0.05μM、0.5μM和1μM）、多效唑:Paclobutrazol(PAC:0.5μM)和萘基鄰氨甲酰苯甲酸:Naphthyphthalamicacid(NPA:0.5μM)激素處理，GA3、PIC、ACC和24-epiBL均能促進(jìn)Col-0、er、phyb和er phyb下胚軸的伸長。其中，蔭蔽環(huán)境下，GA3能夠顯著地促進(jìn)er下胚軸的伸長，并與Col

9、-0下胚軸的長度無差異;而PIC、ACC、24-epiBL則不能。同時，蔭蔽環(huán)境下，與NPA相比，PAC更能顯著抑制下胚軸的伸長。這表明，ER促進(jìn)下胚軸的伸長部分依賴于光敏色素PHYB，且植物激素GA3參與ER介導(dǎo)的避蔭反應(yīng)。
　　8.蔭蔽脅迫下，擬南芥AtER，AtERL1和AtERL2啟動子的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)GUS染色后，與正常光照相比，擬南芥AtER、AtERL1和AtERL2表達(dá)量升高。這表明AtER參與避蔭反應(yīng)，且三個基因在

10、各組織表達(dá)程度不同。經(jīng)過GA3、PIC、ACC、24-epiBL激素處理，無論正常光照或蔭蔽處理，擬南芥AtER，AtERL1和AtERL2表達(dá)量都比空白對照高。同時，蔭蔽處理能進(jìn)一步提高AtER，AtERL1和AtERL2表達(dá)量。其中，在GA3和PIC處理下，擬南芥轉(zhuǎn)基因植株GUS染色更深。同時蔭蔽脅迫下，含大豆GmERs啟動子的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)GUS染色后，與正常光照相比，GmERs在子葉、葉柄和下胚軸中的表達(dá)量上升。這表明，Gm

11、ERs參與避蔭反應(yīng)。
　　9.采用熒光定量PCR試驗(yàn)檢測擬南芥下胚軸中GA和IAA信號通路相關(guān)基因，結(jié)果表明:在蔭蔽處理下，擬南芥Col-0和er下胚軸中AtIAA29、AtGA3OX1、AtGA20OX1、AtPIL1、AtPIF4、AtSA UR68、AtRGA1表達(dá)量在蔭蔽處理下升高，且Col-0中的相關(guān)基因表達(dá)量高于er，而AtGA2OX1，AtGA1表達(dá)量基因表達(dá)量則有降低。這表明，GA和IAA信號通路相關(guān)基因也參與避蔭