低溫脅迫對甘蔗幼苗根系生長代謝的影響和相關基因α-tubulin的功能研究.pdf

1、甘蔗（Saccharum officenarum L.）是中國乃至世界第一大糖料作物，也是重要的能源作物。甘蔗是喜溫作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，需要適宜的溫度和濕度才能正常生長。近年來，世界氣候變化異常，極端低溫頻發(fā)，寒害、凍害增多，給甘蔗生產(chǎn)造成巨大的損失。因此，開展甘蔗抗寒機制的研究具有重要的意義。目前，國內外對甘蔗低溫脅迫下根系的形態(tài)、解剖、生理生化代謝和分子水平等方面研究的綜合報道較少，本研究對甘蔗幼苗進行低溫脅迫處理，從

2、根系形態(tài)、細胞亞顯微結構、生理生化代謝水平與常溫下生長的甘蔗進行比較分析，以期探討低溫脅迫下甘蔗根系的生長、生理生化特性以及相關基因等指標與抗寒性的關系;并對甘蔗微管蛋白α-tubulin基因進行克隆和表達分析，同時對該蛋白進行原核表達、純化并制備單克隆抗體;利用農(nóng)桿菌介導法在煙草和甘蔗上進行遺傳轉化，初步驗證α-tubulin基因在植物耐寒性等的功能。主要的研究內容與結果如下:
　　1.低溫抑制了根系的生長。與正常條件生長的對照

3、根系相比，低溫脅迫下的根系表現(xiàn)根尖發(fā)黃，褐化，壞死;根長和根體積的增加量均顯著低于對照;兩個甘蔗品種（ROC22和GT28）的生物量均比對照明顯降低，但根冠比差異不顯著;兩個品種相比較，發(fā)現(xiàn)ROC22地上部和地下部受低溫影響顯著高于GT28;超微結構觀察結果顯示:低溫脅迫導致根尖細胞由方變圓，結構紊亂，細胞器減少，細胞膜破壞，細胞核解體，線粒體內嵴模糊，逐漸成為空泡狀，部分溶解，ROC22細胞和細胞器受傷害程度大于GT28。
　　

4、2.低溫明顯影響甘蔗根系蛋白質、糖含量以及蛋白酶活性。在低溫脅迫下，ROC22可溶性蛋白質先略微上升后下降，GT28可溶性蛋白質先升高后下降再升高，且保持在較高水平;ROC22氨基酸含量表現(xiàn)為先升高后降低，在第5和9d顯著低于對照，而GT28的氨基酸含量則始終高于對照。ROC22的可溶性糖和非可溶性糖含量逐漸下降，與對照差異顯著，而GT28中可溶性糖逐漸上升，并高于對照組，但非可溶性糖含量則先上升后下降。根系中肽鏈內切酶活性先升高后下降

5、，在弱酸性條件活性高于堿性條件下，并且GT28活性普遍高于ROC22;羧肽酶和氨肽酶在短時間低溫下變化不顯著，但在第9d時ROC22羧肽酶活性激增，氨肽酶活性速降，GT28中這兩個酶活性變化不顯著。
　　3.成功構建pET30a(+)-α-tubulin原核表達載體，利用IPTG誘導產(chǎn)生融合蛋白，原核表達結果顯示重組的pET30a(+)-α-tubulin為49.6kDa。重組蛋白通過Ni2+-NTA柱親和層析純化和透析濃縮后制備

6、單克隆抗體，用ELISA法檢測α-tubulin單克隆的效價，結果表明本研究所制備的α-tubulin單克隆抗體的效價高于1∶512000。用WesternBlot檢測甘蔗α-微管蛋白獲得了特異性的條帶，說明甘蔗α-微管蛋白單克隆抗體己被成功制備。
　　4.利用qRT-PCR技術分析了α-tubulin基因在甘蔗中轉錄水平的表達，結果表明α-tubulin基因在甘蔗莖中的表達量最高，根中次之，葉中最少。低溫脅迫下，α-tubuli

7、n基因在根、莖和葉中的表達量是先升高后降低，最后差異逐漸減小。利用Western Blot方法檢測α-tubulin基因在甘蔗中蛋白質水平的表達，發(fā)現(xiàn)ROC22根中α-微管蛋白表達逐漸下降，而GT28中α-微管蛋白先升高后下降，但都高于對照。
　　5.成功構建了煙草表達載體pBI121-α-tubulin和甘蔗表達載體pCAMBIA3300-α-tubulin。將分別受CaMV35S和Ubi啟動子控制的pBI121-α-tubul

8、in和pCAMBIA3300-α-tubulin通過運用農(nóng)桿菌介導法轉入野生型煙草植株K346和甘蔗品種ROC22，經(jīng)PCR檢測和GFP觀察以及Bar基因檢測確證獲得轉基因煙草和甘蔗。
　　6.對轉α-tubulin基因煙草進行低溫脅迫的功能驗證。野生型和轉基因煙草分別進行28℃（常溫）和0-4℃（低溫）處理，結果表明:低溫脅迫對野生型和轉基因型煙草葉綠素含量影響不顯著。常溫下，轉基因煙草凈光合作用顯著高于野生型煙草，Pn、Gs、

9、Tr顯著高于野生型，而Ci顯著低于野生型煙草。低溫脅迫下，野生型和轉基因煙草的光合作用受到抑制，并且都以呼吸作用為主，由強變弱后穩(wěn)定。低溫下，滲透物質可溶性蛋白質、可溶性糖和脯氨酸含量在轉基因煙草中比野生型煙草中穩(wěn)定。保護酶系統(tǒng)SOD和POD活性先升高后下降，但野生型煙草變化幅度顯著高于轉基因煙草;野生型煙草CAT活性逐漸下降，而轉基因煙草CAT活性先下降后激增。說明α-tubulin的過量表達影響植物體內生理生化特性。
　　7.

10、利用qRT-PCR技術對轉甘蔗α-tubulin基因的煙草進行表達分析，發(fā)現(xiàn)α-tubulin基因在兩種基因型煙草葉脈中表達最高，莖中次之，葉中最低;轉基因煙草葉和莖中α-tubulin基因表達顯著高于野生型煙草，而葉脈中α-tubulin基因表達低于野生型煙草。低溫脅迫下，野生型煙草葉片中α-tubulin基因表達逐漸降低，而轉基因煙草葉片中α-tubulin基因表達有升有降，但顯著高于野生型煙草。WesternBlot檢測α-tub