應(yīng)用青?；【鶴67檢測水質(zhì)急性毒性的研究.pdf

1、應(yīng)用發(fā)光菌對物質(zhì)急性毒性測試的研究在國外開始于80年代中后期。我國1995年環(huán)保局頒布了我國水質(zhì)急性毒性發(fā)光菌檢測方法，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織1998年制定了發(fā)光菌水質(zhì)毒性檢測標(biāo)準(zhǔn)；二者都使用海水中的費希爾弧菌。因海洋發(fā)光菌生境中NaCl濃度較高，用于檢測淡水水質(zhì)急性毒性時需要添加2％的NaCl，國外研究發(fā)現(xiàn)這對毒物毒性會造成干擾。我國特有的淡水發(fā)光菌青?；【鶴67，對NaCl要求不高，適宜對淡水環(huán)境中毒物毒性進行檢測，近年受到廣泛關(guān)注；但與之

2、相配的方法尚不統(tǒng)一，多采用細(xì)菌凍干粉復(fù)蘇發(fā)光后直接檢測水質(zhì)毒性；而采用細(xì)菌凍干粉復(fù)蘇途徑存在以下問題：一是凍干粉制作成本較高，二是復(fù)蘇率差異會影響檢測結(jié)果，三是不能在常溫下攜運。以上特點限制了其推廣應(yīng)用。為保障野外環(huán)境條件下的水質(zhì)安全，本研究從淡水發(fā)光菌生長發(fā)光規(guī)律著手，采用新鮮培養(yǎng)的發(fā)光菌，結(jié)合現(xiàn)代的光電檢測儀器，對水中重金屬毒物(砷、鉻、鉛、鎘、汞)和微囊藻水樣的急性毒性進行了研究，以期為常溫下野外環(huán)境中的發(fā)光菌水質(zhì)急性毒性檢測應(yīng)用

3、打下一定基礎(chǔ)。 本研究第一部分對青?；【鶴67的生理發(fā)光條件進行研究，擬確定最佳發(fā)光狀態(tài)和菌密度，建立檢測體系；為應(yīng)用青?；【鶴67對水質(zhì)急性毒性檢測提供基礎(chǔ)條件。第二部分重點探索單一毒物對青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng)，對單一毒物毒性大小，毒性作用規(guī)律進行研究。第三部分在第二部分基礎(chǔ)上研究二元毒物聯(lián)合毒性作用特點。第四部分為在實踐中驗證該檢測體系，應(yīng)用青?；【鶴67對某庫區(qū)回水區(qū)微囊藻水樣的急性毒性進行檢測。第五部分為給野外環(huán)境

4、中簡單設(shè)備條件下的毒性檢測應(yīng)用提供基礎(chǔ)，探索青?；【鶴67菌液在平皿中較大氧接觸面生長至一定密度后的毒性檢測。各部分結(jié)果如下： 一、應(yīng)用青?；【鶴67對水質(zhì)急性毒性檢測的基礎(chǔ)條件研究 本部分研究通過比較不同pH值、水溫、菌濃度、菌液生長密度(以O(shè)D600值計)下的發(fā)光值以找出最佳發(fā)光條件，并以PbCl2水溶液為代表進行初步毒性效應(yīng)檢測。結(jié)果顯示： (一)最適pH范圍為6～10，以pH7.0最佳。 (二)溫

5、度在15～30℃對Q67菌發(fā)光自然變化無影響，以25℃最佳。 (三)Q67菌液的生長密度在OD600值1.7～1.8間為最佳生理發(fā)光狀態(tài)，但離心濃縮提高菌濃度并不能使菌液發(fā)光成比例上升。 (四)OD600值1.75的Q67生長發(fā)光菌液以蒸餾水作對照，與PbCl2毒性效應(yīng)關(guān)系良好。 通過本部分研究，建立了毒性測試體系：以蒸餾水作對照，測試菌液(OD600值1.7～1.8)與樣本溶液體積比1:10，總體積550ul，

6、pH值7.0，溫度25℃，用于進一步的毒性效應(yīng)檢測研究。 二、水中單一重金屬毒物對青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng) 為探索常溫(25℃)下水中砷、鉻、鉛、鎘、汞對青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng)，選取OD600值1.75最佳發(fā)光狀態(tài)菌液以RS9901生物發(fā)光光度計為測試設(shè)備，按照第一部分研究建立的測試體系，測定水中砷、鉻、鉛、鎘、汞對發(fā)光菌半數(shù)發(fā)光抑制效應(yīng)濃度(EC50)。并對鉻、鉛的不同作用時間的毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)進行了分析。結(jié)果如

7、下： (一)獲得5種毒物的EC50，按毒性由小到大順序為：As(Ⅲ)(EC5010.76mg/L)＜Cr(Ⅵ)(EC507.22mg/L)＜Pb(Ⅱ)(EC505.42mg/L)＜Cd(Ⅱ)(EC501.84mg/L)＜Hg(Ⅱ)(EC501.45mg/L)，從EC50分析，砷、鉻、鉛、鎘4種毒物對青?；【鶴67毒性效應(yīng)明顯。根據(jù)文獻報道數(shù)據(jù)，與基于V.fischeri發(fā)光菌國際標(biāo)準(zhǔn)的Microtox系統(tǒng)凍干粉復(fù)蘇檢測的毒性順序

8、基本一致；且砷、鉻、鎘毒性效應(yīng)檢測較Microtox系統(tǒng)敏感(Microtox，15minEC50分別為43.6、18.0、20.0mg/L)。 (二)毒物Pb(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)的EC50隨作用時間延長呈現(xiàn)指數(shù)曲線下降的規(guī)律，毒性均呈增大趨勢，其方程為：PbCl2EC50(mg/L)=28.344e-0.0966T(R2=0.98，P＜0.0001)；CdCl2EC50(mg/L)=12.028e-0.1298T(R2=0.95

9、，P＜0.0001)。該規(guī)律為進一步深入研究單一毒物對發(fā)光細(xì)菌的毒性作用特點，應(yīng)用該菌區(qū)分毒物提供了線索。 (三)對PbCl2和CdCl2的毒性效應(yīng)(Gamma)、作用濃度(C)、作用時間(T)進行多元回歸擬合分析，建立了PbCl2和CdCl2的毒性效應(yīng)方程，分別為：PbCl2:InGamma=-3.4095+1.02281nC+0.0938T(R2=0.94，P＜0.0001)；CdCl2：InGamma=-3.3301+1.

10、4301nC+0.1692T(R2=0.98，P＜0.0001)。根據(jù)所得方程可以對以上毒物不同濃度不同時間作用下的毒性效應(yīng)進行預(yù)測，對評價毒物整體毒性效應(yīng)具有較重要意義。 三、水中二元聯(lián)合重金屬毒物對青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng) 考慮到現(xiàn)實中可能存在的多種毒物并存情況，在第二部分研究的基礎(chǔ)上，本部分以等毒性濃度比例混合毒物，研究鉛鎘、鉛鉻、鉛砷、砷汞，鉛汞的聯(lián)合毒性作用。結(jié)果：鉛鎘、鉛鉻間存有輕度拮抗效應(yīng)；鉛砷、砷汞間

11、存在較大拮抗效應(yīng)；鉛汞間具有加和作用。提示：多種毒物存在的情況下，即使發(fā)光受抑程度較低，水中也可能含有較高濃度的毒物；在野外自然環(huán)境中一般上述情況較少，但應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)將當(dāng)?shù)厮h(huán)境受工業(yè)污染狀況納入考量。 四、某庫區(qū)回水區(qū)微囊藻水樣對青?；【鶴67的急性毒性效應(yīng) 微囊藻毒素是由藍藻水華中微囊藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，在細(xì)胞死亡后釋放的一種生物毒素。本部分研究通過對某庫區(qū)回水區(qū)微囊藻水樣反復(fù)凍融處理破壞藻細(xì)胞，獲得藻毒素的濃縮液后，應(yīng)用本

12、研究建立的毒性測試體系首次對自然界藻毒素水樣的發(fā)光菌急性毒性進行檢測。結(jié)果： (一)用該發(fā)光菌毒性測試體系分析自然水體水樣獲得較好的濃度效應(yīng)關(guān)系，說明該檢測體系也可用于藻毒素水樣的毒性檢測。 (二)回水區(qū)水體15min作用的EC50(EC50，15min)的百分比濃度為134％。 (三)參照Bulich生物發(fā)光毒性效應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)：EC50百分比濃度＞100％屬無毒，76％～100％屬微毒，本結(jié)果提示：微囊藻繼續(xù)繁殖

13、至密度為原水體的1.34倍時，EC50，15min=100％，達微毒級別；1.34倍微囊藻密度可作為預(yù)警線，微囊藻大于此密度必須及時對水體采取相關(guān)凈化措施以保護生態(tài)環(huán)境。 五、平皿培養(yǎng)法用于Q67菌液生長發(fā)光及相關(guān)毒物毒性檢測研究 由于以往培養(yǎng)Q67菌是采用三角燒瓶，恒溫20℃、180rpm振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，但恒溫振蕩培養(yǎng)箱不便于野外攜帶。有文獻報道菌液發(fā)光與充氧量關(guān)系密切，受此啟發(fā)，利用平皿加少量培養(yǎng)基形成薄層表面，增

14、大菌液與氧的接觸面積，期望能生長到可用于發(fā)光毒性檢測的密度；為野外環(huán)境中有限設(shè)備條件下的毒性檢測應(yīng)用提供基礎(chǔ)。采用0.5mm直徑鎳絲制成的內(nèi)徑2mm接種環(huán)取1環(huán)Q67斜面菌種，加入滅菌平皿(9cm直徑)中2～3mm厚(約10ml)的Q67液體培養(yǎng)基中，常溫下自然生長至發(fā)光狀態(tài)后用于金屬毒物毒性檢測。結(jié)果表明：菌液經(jīng)21.5h達到最佳發(fā)光狀態(tài)(OD600值1.82)；并成功測定了CrO3、PbCl2和CdCl2的EC50,15min值，分

15、別為9.67、4.64和2.63mg/L，與第二部分20℃恒溫振蕩培養(yǎng)獲取的最佳發(fā)光狀態(tài)菌液的常溫下檢測數(shù)據(jù)(分別為7.22、5.42和1.84mg/L)基本一致。說明平皿培養(yǎng)法適宜在野外環(huán)境中簡易設(shè)備條件下最佳發(fā)光狀態(tài)菌液的制備及應(yīng)用于金屬類毒物毒性效應(yīng)的檢測。 全文結(jié)論： 一、本研究確立了新鮮培養(yǎng)Q67發(fā)光菌液用于毒性檢測的體系：使用本研究確立的最佳發(fā)光狀態(tài)菌液(OD600為1.7～1.8)；菌液與樣本溶液體積比1:

16、10，總體積550ul；pH值7.0，溫度為常溫(25℃)，用于檢測重金屬化學(xué)毒物毒性和自然水體中的微囊藻毒素毒性效果較好。研究從菌液生長的密度出發(fā)，確立的菌液最佳發(fā)光狀態(tài)OD600值較容易控制；這與以往單純基于一定發(fā)光強度范圍(200～600萬光子單位)的菌液測試基礎(chǔ)條件相比更加精確，且有較好的通用性，為新鮮培養(yǎng)Q67發(fā)光菌液檢測水質(zhì)急性毒性標(biāo)準(zhǔn)化奠定了一定基礎(chǔ)，避免了使用凍干粉帶來的困擾。 二、本研究發(fā)現(xiàn)的單一金屬毒物EC5

17、0隨作用時間延長呈指數(shù)曲線下降的規(guī)律對應(yīng)用該菌區(qū)分單一毒物提供了線索；建立的單一金屬毒物毒性效應(yīng)回歸模型方程在預(yù)測樣本毒性大小時具有較重要的意義；發(fā)現(xiàn)的二元金屬毒物聯(lián)合作用特點提示重金屬毒性檢測中應(yīng)考量多種毒物混雜的情況；對微囊藻毒素水樣毒性研究獲得較好的濃度效應(yīng)關(guān)系反映應(yīng)用該體系檢測生物毒素效果較好；創(chuàng)造性的利用氧接觸面較大的青海弧菌Q67平皿菌液自然生長發(fā)光狀態(tài)進行毒性檢測，獲得較好的實驗結(jié)果，簡化了發(fā)光細(xì)菌毒性檢測應(yīng)用的平臺，有利