Microtox及TTC-DHA在急性毒性檢測中的應用研究.pdf

1、微生物因具備生長速度快、繁埴周期短、操作運轉費用低及不存在倫理學爭議等諸多優(yōu)點,而被廣泛應用為環(huán)境樣品初篩評價試驗的載體,從而與傳統(tǒng)的化學分析手段及動物實驗方法互為補充。其中基于細菌生物發(fā)光的毒性分析方法Microtox技術和借助人工受氫體的細菌脫氫酶活性檢測技術(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride-dehydrogenase activity,TTC-DHA)在國內外的應用最為廣泛。目前,國內尚未深

2、入對這兩種方法進行綜合性對比的研究,也沒有進一步提高其靈敏度的有效方法。本研究通過探索改善受試細胞的通透性,來提高細菌急性毒性檢測方法的靈敏度,并對這兩種方法進行同步對比分析。
　　第一部分：通透性改善和微孔板技術在Microtox檢測中的應用
　　目的：通過改善明亮發(fā)光桿菌菌體細胞的通透性,來提高Microtox方法毒性檢測的靈敏度,并通過使用微孔板來提高檢測效率,以期對傳統(tǒng)的發(fā)光細菌急性毒性檢測試驗的方法進行改進。

3、>　　方法：以乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-Na2)處理明亮發(fā)光桿菌,用疏水性熒光探針N-苯基-1-萘胺(N-Phenyl-1-naphthylamine,NPN)來檢測其對發(fā)光桿菌細胞外膜通透性的改變。以全黑96孔板為反應板,應用發(fā)光細菌急性毒性檢測技術(Microtox)來監(jiān)測供試毒物在EDTA加入前后的50％發(fā)光抑制濃度值(Effective

4、 concentration,EC50)。
　　結果：1.相對于不加EDTA的檢測系列,40mmol/L的EDTA能使明亮發(fā)光桿菌對NPN熒光吸收的改變最大,NPN吸收系數(shù)由8.8增加到13.0,增幅為47.7%。
　　2.經(jīng)擬合分析,16種毒物對細菌發(fā)光抑制效應的相關度均在96%以上。金屬毒物中的Cu2+、Hg2+和Pb2+在40mmol/LEDTA加入后的EC50值分別有16.93%、14.29%和2.05%的增加,Zn

5、2+的EC50值有4.97%的降低。以EC50值為毒性評價標準,4種重金屬毒物毒性順序為Hg2+>Pb2+>Zn2+>Cu2+。
　　3.12種有機毒物在加入40mmol/L的EDTA后均有EC50值的顯著減小,壬基酚的減小幅度最大,為85.83%;其次是1,10-菲啰啉,減小幅度為27.30%;EC50值減小幅度最小的是α-萘胺,為6.47%。以EC50值為標準的12種有機毒物在通透性改變前的毒性順序為4-異丙基苯酚>1,4-對

6、苯醌>1-萘酚>二苯胍>雙酚A>萘>α-萘胺>4,4’-二氨基聯(lián)苯>甲苯>1,10-二氮雜菲>聯(lián)苯>壬基酚,用40mmol/L的EDTA增加通透性后,壬基酚的毒性高于聯(lián)苯,其他毒物的順序不變。
　　4.較傳統(tǒng)的Microtox檢測法,使用96孔反應板可以減少90%的試劑使用量,節(jié)約95.8%的檢測時間,且使用黑色96板不需對受試樣品的顏色進行校正。
　　結論：1.EDTA可以提高明亮發(fā)光桿菌對有機化合物的通透能力,能使Mic

7、rotox方法對有機物毒性檢測的靈敏度提高。
　　2.與傳統(tǒng)方法相比,使用微孔板的高通量檢測法具備試劑用量少,操作簡便及檢測效率高的優(yōu)點。
　　第二部分：通透性改善技術在TTC-DHA毒性檢測試驗中的應用
　　目的：改善銅綠假單胞菌的細胞通透性,提高2,3,5—氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)-脫氫酶活性檢測試驗對毒物毒性檢測的靈敏度,并與第一部分Mic

8、rotox方法的試驗數(shù)據(jù)比較,分析兩種方法的優(yōu)缺點。
　　方法：以EDTA處理銅綠假單胞菌,用NPN來檢測其對受試菌細胞外膜通透性改變的能力,應用銅綠假單胞菌脫氫酶活性(dehydrogenase activity,DHA)檢測技術來監(jiān)測供試物在細胞通透性改變前后的50%效應濃度值(EC50)。
　　結果：1.在PH8.4Tris-HCl緩沖溶液的環(huán)境中,1.4mmol/L的EDTA能使銅綠假單胞菌對NPN熒光吸收的改變最顯

9、著,NPN吸收系數(shù)由6.5增加到9.6,增幅為47.6%。
　　2.8種供試毒物對銅綠假單胞菌脫氫酶活性抑制效應的相關系數(shù)均>0.97。金屬Hg2+在EDTA加入后的EC50值增加了15.29%,而Pb2+的EC50值減小了0.75%,且Hg2+的毒性較大,與Microtox法的試驗結果一致。
　　3.6種供試有機物在加入1.4mmol/L的EDTA后均有EC50值減小。其中α-萘胺的EC50值僅有0.02%改變,其他毒物的

10、EC50值的改變均在9.19%-17.20之間。6種有機毒物在1.4mmol/LEDTA加入前后的毒性順序均為4-異丙基苯酚>1,4-對苯醌>雙酚A>α-萘胺>甲苯>4,4’-二氨基聯(lián)苯。與Microtox法的試驗結果相比,僅在甲苯與4,4’-二氨基聯(lián)苯之間有毒性順序的不同。
　　4.Microtox檢測法對4-異丙基苯酚、1,4-對苯醌、雙酚A、α-萘胺和4,4’-二氨基聯(lián)苯的檢測靈敏度較高,而TTC-DHA法對Hg2+、Pb2