寧夏野鳥攜帶病毒宏基因組分析.pdf

1、新發(fā)和再發(fā)性傳染病始終威脅著動(dòng)物和人類的健康，發(fā)現(xiàn)并鑒定新病原是預(yù)防傳染病大范嗣傳播的關(guān)鍵。野鳥是許多重要的致病性病毒的自然宿主，并且能將這些病毒傳播給人和其他動(dòng)物而引起發(fā)病。寧夏作為中亞野鳥遷徙路線的重要節(jié)點(diǎn)，擁有大片濕地，是野鳥繁殖和遷徙的停歇地之一，大批野鳥在這里聚集，為各種鳥類疫病在不同種群間的傳播提供了條件。
　　為了解寧夏野鳥攜帶病毒的自然本底和多樣性，發(fā)現(xiàn)潛在感染人或畜禽的病毒。本研究以偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物為研究對(duì)象

2、，摸索并建立適用于高通量測(cè)序的樣本前處理方法:首先將偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行差速離心，除去細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)，加入不同劑量的核酸酶處理，提取核酸，通過熒光定量PCR檢測(cè)病毒的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在150 uL樣品中，加20 uLDNaseⅠ時(shí)，對(duì)病毒含量無影響且對(duì)宿主核酸和游離核酸去除效果較佳，依據(jù)此結(jié)果確定了病毒宏基因組樣品前處理方法。利用已建立的樣本前處理方法，對(duì)寧夏石嘴山市、中寧市和青銅峽市采集的14種119只野鳥糞便進(jìn)行了前期處理，隨

3、后提取其全部核酸，經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增后進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序，利用SOAPdenove軟件將獲得的32385000個(gè)讀長(zhǎng)(reads)拼接成163192個(gè)重疊序列(Contig)，再與NCBI病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，分析樣本中病毒的種類及豐度，并選取注釋到禽流感病毒和圓環(huán)病毒進(jìn)行特異性檢測(cè)，驗(yàn)證病毒宏基因組注釋結(jié)果。通過序列注釋發(fā)現(xiàn)，0.4％重疊序列與病毒相關(guān)，能進(jìn)一步注釋到19個(gè)病毒科，其中63％的病毒序列是噬菌體，33％的是

4、脊椎動(dòng)物病毒，3％的是昆蟲病毒，1％的是植物病毒。注釋到的脊椎動(dòng)物病毒共有16種，分布于11個(gè)病毒科，其中包含有禽流感病毒、札幌病毒等人畜共患性病毒，禽流感病毒和圓環(huán)病毒特異性PCR檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)了病毒宏基因組注釋結(jié)果正確。
　　本研究初步建立了高通量測(cè)序前樣品的處理方法，為有效全面的獲得樣品中病毒奠定了基礎(chǔ)。利用病毒宏基因組方法對(duì)寧夏野鳥糞便病毒組進(jìn)行分析，本研究結(jié)果不僅豐富了野鳥攜帶病毒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資源，同時(shí)還提示寧夏地區(qū)野鳥存在