聲敏劑Sonoflora介導(dǎo)的聲動(dòng)力治療小鼠S180肉瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤已成為危害人類(lèi)健康和生命的主要疾病之一。據(jù)目前最新調(diào)查結(jié)果顯示:我國(guó)腫瘤引起的死亡率在所有疾病病因中居第2位(占17.9％)，并且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。如何診治腫瘤是目前醫(yī)學(xué)界的重大難題之一，繼傳統(tǒng)的手術(shù)、化療及放療等治療方式之后，腫瘤的分子靶向治療在現(xiàn)代腫瘤治療模式中產(chǎn)生了劃時(shí)代的意義。然而，目前研發(fā)的靶向藥物雖然副作用較小，但只對(duì)部分具有特異性靶點(diǎn)的腫瘤療效好，而大部分腫瘤患者的獲益率低。因此，尋找靶向性好、副作用小、總體

2、人群有效率高的惡性腫瘤治療新方法，是腫瘤界面臨的重大課題。聲動(dòng)力學(xué)療法(Sonodynamic therapy，SDT)是在光動(dòng)力學(xué)療法（Photodynamic therapy，PDT）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種腫瘤治療新理念，是通過(guò)靜脈注射或口服聲敏劑，聲敏劑通過(guò)血流靶向性在腫瘤組織中聚集，然后利用低強(qiáng)度的超聲照射腫瘤，以聲能激活聲敏劑，使其在腫瘤局部產(chǎn)生一系列理化反應(yīng)（如聲致發(fā)熱、單線態(tài)氧、羥自由基等），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不可逆性損傷，而達(dá)

3、到抗腫瘤治療的一種新手段。SDT將超聲深部無(wú)創(chuàng)穿透能力及精確定位能力與聲敏劑對(duì)腫瘤組織的靶向性相結(jié)合，確保了對(duì)表淺及深部的各種腫痛靶向性治療。因其無(wú)創(chuàng)性和靶向性成為腫瘤治療的一種新方法，有著廣闊的發(fā)展前景。但是既往使用的聲敏劑多為血卟啉的衍生物（如HPD、PhotofrinⅡ），存在聲動(dòng)力效應(yīng)差、靶向性不高、排泄緩慢，易發(fā)生光敏反應(yīng)等問(wèn)題。雖以葉綠素為原料合成的新型聲敏劑如二氫卟吩e4、二氫卟吩e6，克服了血卟啉衍生物的缺點(diǎn)，但國(guó)內(nèi)無(wú)知

4、識(shí)產(chǎn)權(quán)，進(jìn)口價(jià)格昂貴，亦限制了其在聲動(dòng)力治療領(lǐng)域的應(yīng)用。我們以光合作用強(qiáng)、毒副作用小的葉綠素為原始合成原料，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬分子結(jié)構(gòu)改造、修飾等過(guò)程，在葉綠素卟啉母體上引入兩個(gè)特定的長(zhǎng)鏈型氨基酸基團(tuán)作為接收聲波的“天線”，合成新型聲敏劑Sonoflora。目前Sonoflora的生物學(xué)效應(yīng)、毒理實(shí)驗(yàn)及光聲譜性質(zhì)已被驗(yàn)證;但聲敏劑在腫瘤細(xì)胞及組織的靶向性聚集、抗腫瘤作用以及安全性，仍未開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)采用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)、腫瘤抑制試驗(yàn)、血常

5、規(guī)生化檢驗(yàn)等方法驗(yàn)證聲敏劑在小鼠S180肉瘤模型中靶向聚集性、抗腫瘤效應(yīng)、毒副反應(yīng)等;為最終挑選出高效、低毒且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型聲敏劑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并將推動(dòng)聲動(dòng)力治療在臨床腫痛靶向性治療領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用，具有重大的理論意義、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 目的：本研究的第一個(gè)目的是采用用共聚焦顯微鏡觀測(cè)Sonoflora在小鼠S180肉瘤模型中腫瘤靶向聚集性，探索給藥后最佳的超聲輻射時(shí)間。第二個(gè)目的是研究Sonoflora聯(lián)合超

6、聲對(duì)S180肉瘤的殺傷作用，探索最佳的聲動(dòng)力治療模式。第三個(gè)目的是研究觀察Sonoflora（10、20、40 mg/kg）腹腔注射后3h～72h對(duì)S180肉瘤荷瘤小鼠血常規(guī)、生化指標(biāo)的影響，判斷其安全性。
　　 方法：⑴S180肉瘤細(xì)胞株在小鼠腹腔傳代7次，待細(xì)胞株生長(zhǎng)穩(wěn)定后，取腹腔傳代第8天的S180肉瘤細(xì)胞懸液，加無(wú)菌生理鹽水，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。去除小鼠右側(cè)腋毛，取0.2ml細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下。腋下

7、接種7天后，電了游標(biāo)卡尺測(cè)得腫瘤平均直徑約0.7cm后用于實(shí)驗(yàn)。⑵選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠35只，隨機(jī)分7組，每組5只。在暗室內(nèi)腹腔注射Sonoflora10mg/Kg，避光避聲飼養(yǎng)，分別于注射后3、6、12、18、24、48、72h斷頸處死荷瘤小鼠，剝離腫瘤和正常肌肉組織，制備冰凍切片，并在激光共聚焦顯微鏡下觀測(cè)腫瘤和肌肉組織的熒光顯像及熒光強(qiáng)度（顯示為紅色熒光）。⑶選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠50只，隨機(jī)分組，每

8、組5只小鼠。(1)對(duì)照組(C):腹腔注射無(wú)菌生理鹽水組;(2)單純超聲組:聲強(qiáng)分別設(shè)定為0.4W/cm2(U1)、0.8W/cm2(U2)、1.6W/cm2(U3);(3)單純Sonoflora組:濃度分別設(shè)定為10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40mg/kg(S3);(4)超聲+Sonoflora組:Sonoflora濃度定為10 mg/kg，聲強(qiáng)分別設(shè)定為0.4W/cm2(S1U1)、0.8W/cm2(S1U2)、1.

9、6W/cm2(S1U3)。在暗室內(nèi)腹腔注射Sonoflora，避光避聲飼養(yǎng)，聲敏劑注射18h后進(jìn)行超聲處理，超聲輻照時(shí)間固定為180s。每2天用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。計(jì)算腫瘤體積公式:腫瘤體積=π/6[（長(zhǎng)徑+寬徑）/2]3。15天后脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，電子天平稱(chēng)重，比較瘤體重量。⑷選取腫瘤大小均一，體重相近的荷瘤小鼠140只，隨機(jī)分4大組:對(duì)照組(C);腹腔注射Sonoflora10mg/kg組;20mg

10、/kg組;40mg/kg組。每大組35只荷瘤小鼠，再隨機(jī)分為7組，每小組5只老鼠。避光避聲飼養(yǎng)，并分別于給藥后3、6、12、18、24、48、72h，采用摘眼球取血法取血，放入EDTA血常規(guī)管，取血液約1.5 ml混勻后在2h內(nèi)給予送檢檢驗(yàn)科，檢測(cè)血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、直接膽紅素、肌酐、尿素氮、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸。⑸統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組之間比較采

11、用t檢驗(yàn)，多組之間比較采用one-way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①腹腔注射后3h后，Sonoflora（10mg/kg）在腫瘤組織中含量開(kāi)始顯著高于正常肌肉組織(P＜0.05)，持續(xù)至48h。其中18h時(shí)Sonoflora在腫瘤和正常肌肉組織含量均達(dá)最高峰，且此時(shí)差異最明顯，腫瘤組織熒光強(qiáng)度是正常肌肉組織的5.33倍。72h后腫瘤及正常肌肉組織熒光均明顯減弱甚至消失。鑒于18h腫瘤組

12、織聲敏劑含量與正常肌肉含量之比最大，此時(shí)若對(duì)腫瘤進(jìn)行輻照處理，既可有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，又對(duì)周?chē)＝M織損傷較小，我們選用這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行聲動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。②單獨(dú)應(yīng)用超聲或Sonoflora對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響通過(guò)對(duì)各組小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)趨勢(shì)及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，單純超聲組0.4 W/cm2(U1)、0.8 W/cm2(U2)、1.6 W/cm2(U3)組，單純Sonoflora10mg/kg(S1)、20mg/kg(S2)、40 mg/

13、kg(S3)組組間比較及與空白對(duì)照組(C)對(duì)比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。提示單獨(dú)使用超聲照射(0.4、0.8、1.6W/cm2)或單獨(dú)注射Sonoflora(10、20、40 mg/kg)均不能明顯有效的抑制腫痛生長(zhǎng)。③Sonoflora介導(dǎo)的聲動(dòng)力對(duì)S180肉瘤的殺傷作用通過(guò)對(duì)各組小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)趨勢(shì)及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，單純0.8 W/cm2超聲組(U2)、單純10mg/kg Sonoflora(S1)與空白對(duì)照

14、組(C)對(duì)比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而0.8 W/cm2超聲和10mg/kg Sonoflora聯(lián)合治療組(S1U2)其腫瘤體積及重量較單純超聲(U2)、單純聲敏劑(S1)及對(duì)照組(C)顯著減少(P＜0.05)。提示超聲聯(lián)合Sonoflora(10mg/kg+0.8W/cm12)介導(dǎo)的聲動(dòng)力具有協(xié)同抗腫瘤作用。④Sonoflora介導(dǎo)的聲動(dòng)力療效與超聲波的強(qiáng)度關(guān)系通過(guò)對(duì)各組小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)趨勢(shì)及最終腫瘤平均重量的比較可以發(fā)現(xiàn)，

15、3組聲動(dòng)力組10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)、10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)與空白對(duì)照組(C)對(duì)比均有顯著性差異(P＜0.05)，10mg/kg+0.4 W/cm2(S1U1)與10mg/kg+0.8 W/cm2(S1U2)、10mg/kg+1.6 W/cm2(S1U3)對(duì)比有顯著性差異(P＜0.05)，而10mg/kg+0.8 W/cm2(S1 U2)與10

16、mg/kg+1.6 W/cm2(S1 U3)對(duì)比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。提示Sonoflora濃度為10mg/kg情況下，0.4、0.8、1.6W/cm2強(qiáng)度的介導(dǎo)的聲動(dòng)力均對(duì)S180腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用(P＜0.05)，而固定Sonoflora濃度為10mg/kg情況下，0.8W/cm2強(qiáng)度介導(dǎo)的聲動(dòng)力已達(dá)最大抑制腫瘤強(qiáng)度。⑤四組瘤荷瘤小鼠的腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、直接膽

17、紅素、乳酸脫氫酶、磷酸肌酸無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。Sonoflora40mg/kg腹腔注射后48h、72h的血肌酐與對(duì)照組、20mg/kg、10mg/kg組有顯著性差異(p＜0.05);72h的血尿素氮也與對(duì)照組、20mg/kg、10mg/kg組有顯著性差異(p＜0.05)。提示Sonoflora濃度40mg/kg腹腔注射對(duì)荷瘤小鼠腎功有損害作用，導(dǎo)致血肌酐、尿素氮升高。而10mg/kg、20mg/kg濃度的Sonoflora對(duì)荷

18、瘤小鼠血常規(guī)、腎功、肝功、心功的無(wú)損害作用。
　　 結(jié)論：⑴在S180荷瘤小鼠中，Sonoflora具有腫瘤靶向性好、體內(nèi)代謝快的優(yōu)點(diǎn);Sonoflora腹腔注射后18h是進(jìn)行超聲處理的理想時(shí)間點(diǎn)。⑵在Sonoflora10mg/kg的濃度下，超聲聯(lián)合Sonoflora顯著抑制小鼠S180肉瘤生長(zhǎng)，且0.8W/cm2強(qiáng)度介導(dǎo)的聲動(dòng)力達(dá)最大抑制腫瘤，與1.6 W/cm2無(wú)顯著性差別(P＞0.05)。⑶10～20mg/kg濃度的So