亞甲藍(lán)光化學(xué)法對血液及血制品中淋巴細(xì)胞及病毒的滅活效果及其機(jī)理.pdf

1、輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可或缺的治療手段，且隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展以及社會老齡化程度的提高，臨床上對血液的需求持續(xù)增加，輸血的重要性愈加彰顯。然而，輸血亦可能發(fā)生不良反應(yīng)，嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)甚至可給受血者帶來災(zāi)難性的后果。受血者遭遇輸血不良反應(yīng)的可能性稱為輸血風(fēng)險，由于輸血治療涉及臨床各科，覆蓋范圍廣、其個案累計絕對數(shù)相當(dāng)可觀，因此，如何在確保臨床輸血療效的同時防范輸血風(fēng)險一直是世界衛(wèi)生組織、各國衛(wèi)生行政部門和醫(yī)學(xué)界共同關(guān)注的熱點問題。

2、　　 輸血風(fēng)險包括感染性風(fēng)險及非感染性風(fēng)險兩大類。感染性風(fēng)險由可通過輸血傳播的病原微生物構(gòu)成，其中包括人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多種病毒以及細(xì)菌和原蟲等。非感染性輸血風(fēng)險則主要由免疫因素引起的輸血不良反應(yīng)所構(gòu)成。輸血相關(guān)的移植物抗宿主病(TA-GVHD)則是后果最為嚴(yán)重的非感染性風(fēng)險之一，它是由輸注了一定數(shù)量的具有免疫活性的異體淋巴細(xì)胞所引起的致命性輸血并發(fā)癥，目前尚無有效的治療措施，

3、一旦罹患，死亡率高達(dá)90％以上。
　　 血液成分的病原體滅活技術(shù)是阻斷輸血傳播病原體，保障輸血安全的重要防線。亞甲藍(lán)光化學(xué)法是可用于單袋血漿病毒滅活的病原體滅活技術(shù)，已在我國和部分歐洲國家應(yīng)用于臨床，其有效性及安全性已得到證實。亞甲藍(lán)是一種帶正電荷的小分子化合物，可穿過病毒的包膜與核酸結(jié)合，并在吸收可見光提供的能量后發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，介導(dǎo)核酸損傷，阻止核酸復(fù)制從而導(dǎo)致病原體的滅活。根據(jù)這一原理，理論上該方法也同樣適用于淋巴細(xì)胞的滅

4、活從而達(dá)到預(yù)防TA-GVHD的目的。該原理還為利用核酸擴(kuò)增技術(shù)評價亞甲藍(lán)病毒滅活效果奠定理論基礎(chǔ)。
　　 目的：1)研究亞甲藍(lán)光化學(xué)法對人外周血淋巴細(xì)胞在細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌方面的作用，并對淋巴細(xì)胞滅活機(jī)理進(jìn)行探討。2)進(jìn)一步深入研究亞甲藍(lán)光化學(xué)法對病毒的滅活效果及其機(jī)理，建立熒光定量PCR技術(shù)對亞甲藍(lán)病毒滅活效果的評價方法，并通過無感染性的可度量核酸破壞程度的質(zhì)控品建立更為安全、有效的病毒滅活效果評價體系。
　　 方

5、法：1)向人外周血淋巴細(xì)胞中加入終濃度3μM的亞甲藍(lán)，將混勻后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至PVC儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活箱中，在照射強(qiáng)度為35000lux的熒光光源下照射50min，作為實驗組。將淋巴細(xì)胞在輻射劑量為25Gy的γ射線下輻照作為輻照組。將處理前后的樣品進(jìn)行淋巴細(xì)胞形態(tài)、存活趨勢、增殖抑制率、細(xì)胞因子分泌以及細(xì)胞凋亡等檢測，分析亞甲藍(lán)光化學(xué)作用對淋巴細(xì)胞的滅活效果及其機(jī)理。2)亞甲藍(lán)光化學(xué)法對Sindbis病毒的滅活處理條件如下：a.

6、將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度為1μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，在光照強(qiáng)度為15000 lux的熒光光源下照射，分別于光照0、1、3、5、7、10、20、30min時取樣檢測；b.將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度為1μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，分別于光照強(qiáng)度為0 lux、2000 lux、5000 lux、10000 lux、20000

7、lux、30000 lux和40000lux的熒光光源下照射5min后取樣檢測；c.將病毒懸液于避光條件下加入亞甲藍(lán)，使其終濃度分別為0μmol/L、0.1μmol/L、0.51μmol/L、0.7μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L，將病毒懸液轉(zhuǎn)移至儲血袋內(nèi)并置于4℃病毒滅活照射箱中，在光照強(qiáng)度為15000lux的熒光光源下照射5min后取樣檢測。每組實驗重復(fù)3次。所有樣品均平行檢測其病毒殘余滴度并

8、通過定量PCR檢測樣品中病毒核酸含量，分析病毒感染性的下降與其核酸損傷之間的相關(guān)性。向HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒懸液及HCV病毒樣顆粒中加入終濃度lμM的亞甲藍(lán)并將樣品轉(zhuǎn)移至儲血袋，于4℃病毒滅活箱中在光照強(qiáng)度為35000lux的熒光光源下光照30min，于不同時間點取樣并通過定量PCR檢測樣品中核酸含量，探討定量PCR技術(shù)評價亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活效果的可行性，同時分析HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒及HCV病

9、毒樣顆粒作為度量病毒核酸破壞程度質(zhì)控品的可行性。
　　 結(jié)果：1)亞甲藍(lán)光化學(xué)法能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌。熒光染色及細(xì)胞存活趨勢結(jié)果顯示實驗組活性細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組及輻照組。實驗組淋巴細(xì)胞在PHA刺激下其增殖集落明顯小于其他處理組；PHA刺激后3d、4d、5d的增殖抑制率分別為89.31％、100％和94.39％，均高于輻照組。經(jīng)PHA刺激后的實驗組細(xì)胞IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的分泌量顯

10、著低于PHA刺激后的對照組，TNF-α、IL-2和IL-12的分泌量與對照組沒有顯著性差異；經(jīng)PHA刺激后的實驗組細(xì)胞除IL-12外，其余細(xì)胞因子的分泌量均顯著低于PHA刺激后的輻照組細(xì)胞；除TSF-α和IL-8外，PHA刺激的實驗組細(xì)胞細(xì)胞因子分泌量與未經(jīng)PHA刺激之間無顯著性差異。亞甲藍(lán)光化學(xué)作用后的淋巴細(xì)胞未檢測到caspase-3、caspase-6的蛋白活性以及DNA Ladder、未出現(xiàn)明顯的磷脂酰絲氨酸外翻，推斷亞甲藍(lán)光化

11、學(xué)作用導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞的無序死亡。2)在上述a、b、c三種亞甲藍(lán)光化學(xué)滅活處理Sindbis病毒的條件下，Sindbis病毒的滅活效果最終均達(dá)6.0 Log TCID50以上，且病毒核酸含量的下降與病毒感染性的消失均具有線性相關(guān)性(R2>0.94.)，方差分析顯示兩者間具有極顯著的線性相關(guān)性(F<0.01)。HCV血漿、熱力預(yù)滅活的Sindbis病毒均與活性Sindbis病毒具有相似的核酸動力學(xué)曲線及擴(kuò)增抑制曲線；HCV病毒樣顆粒與HCV

12、血漿具有相似的核酸動力學(xué)曲線及擴(kuò)增抑制曲線，且兩者的核酸下降量呈現(xiàn)極顯著的線性相關(guān)性(R2>0.99)。
　　 結(jié)論：1)亞甲藍(lán)光化學(xué)作用可以有效滅活淋巴細(xì)胞，抑制其細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌(國內(nèi)首次報道)。2)亞甲藍(lán)光化學(xué)作用可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的無序死亡(首次發(fā)現(xiàn))。3)亞甲藍(lán)光化學(xué)法造成了病毒核酸的損傷，且通過病毒核酸含量下降與病毒感染性消失的平行觀察證實核酸是亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活的主要作用靶點，并為熒光定量PCR技術(shù)評價亞甲藍(lán)