核黃素光化學(xué)作用滅活血液及血制品中的淋巴細(xì)胞及病原微生物的研究.pdf

1、背景輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不可或缺的重要支撐條件,且隨著臨床醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和社會(huì)老齡化程度的提高,其重要性必然隨之進(jìn)一步突顯；但另一方面輸血亦和多數(shù)臨床治療方法一樣,存在著一定的不良反應(yīng),受血者遭遇輸血不良反應(yīng)的可能性稱為輸血風(fēng)險(xiǎn)。雖隨著輸血相關(guān)管理和技術(shù)措施的改進(jìn),輸血風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生幾率已大幅度降低,但由于輸血治療覆蓋面廣、使用量大,其個(gè)案累計(jì)絕對(duì)數(shù)仍相當(dāng)大,因此,如何在確保臨床輸血療效的同時(shí)防范輸血風(fēng)險(xiǎn)一直是世界衛(wèi)生組織、各國衛(wèi)生行政部門和醫(yī)學(xué)

2、界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。 輸血風(fēng)險(xiǎn)主要由感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)和免疫性輸血不良反應(yīng)兩大類構(gòu)成。艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等多種病毒及某些細(xì)菌、原蟲等諸多病原微生物可通過輸血途徑傳播而構(gòu)成感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)；輸血相關(guān)移植物抗宿主病(TA-GVHD)則是后果最為嚴(yán)重的免疫性輸血風(fēng)險(xiǎn),一旦罹病,其死亡率高達(dá)90％以上。血液成分病原體滅活是杜絕感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵技術(shù),核黃素光化學(xué)法(Riboflavin p

3、hotochemical treatment,RPT)是近年來在血液成分病原微生物滅活研究領(lǐng)域中被密切關(guān)注方法,其有效性和安全性已得到證實(shí)?，F(xiàn)知核黃素能與核酸結(jié)合,在光能作用下所發(fā)生的后續(xù)反應(yīng)可導(dǎo)致核酸斷裂并阻止核酸復(fù)制,由于這一原理在邏輯上亦適用于血液制品中淋巴細(xì)胞的滅活,因而引起了有關(guān)研究者的興趣。用RPT方法滅活T淋巴細(xì)胞以預(yù)防TA-GVHD研究的預(yù)期目標(biāo)是建立一種事半功倍、能同時(shí)滅活病原微生物和淋巴細(xì)胞的方法,以簡化血液安全處理

4、的程序,避免反復(fù)處理對(duì)血液成分造成的不良影響。核黃素作為一種人體所必需的維生素,具有對(duì)人體無害的特點(diǎn)。 目的本研究中擬用400nm～500nm波段的可見光替代目前多數(shù)研究中使用的紫外光源,減少光源本身對(duì)血液成分的不良影響,研究該波段光源所激發(fā)的核黃素光化學(xué)反應(yīng)對(duì)淋巴細(xì)胞,細(xì)菌,病毒的滅活作用,并對(duì)其滅活病原體的機(jī)理進(jìn)行探討分析。 方法將含有淋巴細(xì)胞或者細(xì)菌、病毒的培養(yǎng)液輸注入血袋中,再加入核黃素溶液,核黃素終濃度為100

5、umol/L,混勻后將血袋放在控溫光照儀中,從血袋上下兩側(cè)照射,照射劑量為8.0J/ml～32.0J/ml,照射時(shí)溫度為4℃。照射后標(biāo)本通過淋巴細(xì)胞存活趨勢,增殖抑制率,細(xì)胞周期,細(xì)胞因子分泌量,細(xì)胞形態(tài)變化,細(xì)胞凋亡及核酸損傷等檢測,分析核黃素光化學(xué)作用滅活淋巴細(xì)胞的效果和機(jī)理；通過大腸桿菌培養(yǎng),電鏡觀察,核酸檢測分析核黃素光化學(xué)作用滅活大腸桿菌的效果和機(jī)理；通過病毒滴度檢測(細(xì)胞病變法),電鏡觀察和核酸檢測分析核黃素光化學(xué)作用對(duì)si

6、ndbis病毒的滅活效果和機(jī)理。結(jié)果可見光激發(fā)下的核黃素光化學(xué)作用可抑制淋巴細(xì)胞增殖,使淋巴細(xì)胞在形態(tài)和功能上都失去增殖特征,導(dǎo)致淋巴細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞對(duì)PHA和CD3單抗刺激后的增殖抑制率分別達(dá)(99.01±1.30)％和(99.14±1.00)％；EPT可阻止淋巴細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞因子分泌,經(jīng)PHA刺激后,實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β,IL-2,IL-6,IL-8,TNF-α和IFN-γ分泌量受到抑制分別達(dá)95.0

7、9％±2.60％,98.20％±1.64％。98.77％±0.97％,92.30％±11.04％,98.82％±1.42％和100％,經(jīng)CD3單抗和CD28單抗刺激后,實(shí)驗(yàn)組淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α,IFN-Y分泌量受到抑制達(dá)89.13％±14.73％,99.02％±0.72％,94.35％±4.93％,84.41％±19.55％和100％；核黃素光化學(xué)作用滅活后的淋巴細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹破裂,細(xì)胞核

8、聚縮,無DNA ladder出現(xiàn),未檢測到磷脂酰絲氨酸發(fā)生外翻,無caspase-3蛋白表達(dá),bax基因轉(zhuǎn)錄量未增加,bcl-2基因轉(zhuǎn)錄未降低,細(xì)胞DNA嚴(yán)重?fù)p傷,導(dǎo)致一部分淋巴細(xì)胞在滅活過程中死亡,另一部分淋巴細(xì)胞滅活后進(jìn)入無序壞死直至死亡。相同波段內(nèi),核黃素光化學(xué)作用可以有效滅活大腸桿菌和sindbis病毒分別達(dá)6log和5log,使大腸桿菌和sindbis病毒的核酸受到損傷,影響核酸的復(fù)制,導(dǎo)致大腸桿菌和sindbis病毒的死亡。