睪酮對(duì)心臟老化過程中心肌纖維化的干預(yù)研究.pdf

1、背景和目的： 隨著衰老，心臟發(fā)生了與衰老相關(guān)的生物化學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的變化從而導(dǎo)致了病理生理學(xué)狀況的改變。心臟老化的過程中，心肌細(xì)胞以及心肌成纖維細(xì)胞也逐漸衰老，同時(shí)心肌膠原含量逐漸增加，異常聚積在心肌間質(zhì)和血管周圍，形成了心肌纖維化。心肌纖維化不僅是高血壓、冠心病及心力衰竭等疾病心臟重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一，也是心臟老化的重要特征。心肌的纖維化則對(duì)心臟產(chǎn)生不利的影響，引起心肌結(jié)構(gòu)紊亂，僵硬度增加，心臟順應(yīng)性降低，心律失常以

2、及頑固性心衰的發(fā)生率增高。因此急需開展心肌纖維化發(fā)病機(jī)制及防治對(duì)策的研究。 對(duì)于在心臟老化的過程中心肌纖維化機(jī)制的研究首先涉及的是衰老機(jī)制問題。目前有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說有數(shù)十多種，總體來說最終歸結(jié)為兩大類型：一類是以活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）、糖基化、線粒體受損等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論，另一類是以端?？s短、衰老基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論，這兩大類理論從不同角

3、度闡述了機(jī)體衰老的可能機(jī)制，使衰老的研究不斷向細(xì)胞、分子和基因水平深入。在關(guān)于心臟老化的眾多衰老學(xué)說中，以ROS為基礎(chǔ)的氧化應(yīng)激學(xué)說最被廣泛認(rèn)同。因此對(duì)于心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制的研究我們可以以此為線索展開。 在衰老過程中，除了心臟衰老本身因素之外，老年人易發(fā)心肌纖維化的另一個(gè)具有顯著特點(diǎn)的危險(xiǎn)因素是體內(nèi)隨年齡增加而發(fā)生的性激素平衡的改變。在增齡過程中，體內(nèi)性激素發(fā)生相應(yīng)變化，其中性激素水平在更年期后發(fā)生的變化顯示出性激素對(duì)機(jī)體作用

4、的重要性。男性睪酮水平隨年齡的變化與男性心臟結(jié)構(gòu)隨年齡增長(zhǎng)發(fā)生的變化之間有無一定的聯(lián)系呢？目前研究還較少。睪酮對(duì)心臟老化過程中心肌成纖維細(xì)胞的影響，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。其可能的作用機(jī)制也還沒有明確。 因此，我們使用低濃度H2O2誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞衰老，通過觀察測(cè)定心肌成纖維細(xì)胞在ROS的作用下各種衰老指標(biāo)（細(xì)胞增殖能力、β-半乳糖苷酶的表達(dá)）、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平、細(xì)胞周期、a平滑肌肌動(dòng)蛋白（a SMA）以及TGF-β1mRNA以

5、及P16mRNA，cyclinD1 mRNA表達(dá)變化，以探討心肌成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制，并予睪酮及其受體拮抗劑干預(yù)，探討生理濃度睪酮對(duì)活性氧誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞早衰的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制，為明確睪酮在干預(yù)心臟老化過程中心肌纖維化的作用，及其作用機(jī)制提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，或許能為心臟老化過程中心肌纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。 方法： 1、培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞，采用第4～6代細(xì)胞。使用60μmol/L H2O2作用72h誘導(dǎo)

6、心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老。 2、分組：（1）A組（對(duì)照組）：低血清培養(yǎng)液（2％FCS）培養(yǎng)細(xì)胞；（2）B組：用含60μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)液作用細(xì)胞72 h；（3）C組：在H2O2刺激組基礎(chǔ)上，在H2O2刺激前1h先用睪酮30nmol/L刺激；（4）D組：在睪酮作用組基礎(chǔ)上，在睪酮刺激前30 min先用氟他胺1μmol/L刺激。 3、用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞的衰老，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）法檢測(cè)

7、細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，DCF熒光顯色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。a平滑肌肌動(dòng)蛋白（aSMA）免疫化學(xué)染色反映細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，RT-PCR法檢測(cè)TGF-β1mRNA以及P16mRNA，cyclinD1 mRNA表達(dá)。 統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），滿足方差齊性的多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性的多重比

8、較采用Dunnett's T3法。P<0．05（雙側(cè)）表示差異有顯著性。 結(jié)果: 1、各組細(xì)胞增殖率的比較與A組比較，B組可以引起心肌成纖維細(xì)胞增殖率明顯下降（P=0．000）。生理濃度（30nmol/L）的睪酮具有增加H2O2誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖率的趨勢(shì)，與B組比較均有顯著差異（P=0．000）。Flu卻可以增加H2O2誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖率，差異也具有顯著性（P=0．000）。 2、各組SA-β-半乳

9、糖苷酶（SA-β-galactosidase）染色陽(yáng)性率比較與A組相比，B組陽(yáng)性細(xì)胞率增多具有顯著性意義（P=0．000）；而生理濃度（30nmol/L）的睪酮能干預(yù)H2O2的作用（P=0．000）；而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性（P=0．000）。 3、各組細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的比較與A組相比，B組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升（P=0．000）；而生理濃度（30nmol/L）的睪酮能干預(yù)H2O2的作用（P

10、=0．000），而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性（P=0．000）。 4、各組細(xì)胞的a SMA免疫化學(xué)染色 4．1, A組心肌成纖維的a-SMA免疫化學(xué)染色部分細(xì)胞輕度著色，無明顯的結(jié)構(gòu)定位特征。B組a-SMA免疫化學(xué)染色出現(xiàn)明顯強(qiáng)陽(yáng)性，雖然不同細(xì)胞的染色強(qiáng)度不完全一致，但結(jié)構(gòu)定位明顯，呈絲狀分布。C組生理濃度的睪酮僅有部分細(xì)胞輕度著色，無明顯的結(jié)構(gòu)定位特征。D組細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性，著色的結(jié)構(gòu)定位不甚明顯。

11、 4．2,與A組相比，B組的細(xì)胞內(nèi)a SMA含量顯著上升（P=0．000）；而生理濃度（30nmol/L）的睪酮能使細(xì)胞內(nèi)a SMA含量下降（P=0．000），而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性（P=0．000）。 5、各組細(xì)胞周期分析與A組相比，B組細(xì)胞大部分處于G0/G1期，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞增殖能力明顯下降；與B組相比較，C組減少G0/G1期比例，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000）；D組較C組作用減弱，具有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000）。D組與B組相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0．393） 6、各組TGF mRNA、P16mRNA、cyclinD1 mRNA的表達(dá)及分析．與A組的P16mRNA、cyclinD1 mRNA、 TGF mRNA相比，B組的細(xì)胞表達(dá)的mRNA顯著升高（P=0．000）。而生理濃度（30nmol/L）的睪酮能抑制H2O2的作用（P=0．000）；而Flu即可阻斷睪酮的保護(hù)作用，差異也具有顯著性（P=0．000）

13、。 結(jié)論: 1、60μmol/L H2O2作用72 h能夠誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞發(fā)生提前衰老。 2、生理濃度的睪酮能夠抑制活性氧誘導(dǎo)的早衰的心肌成纖維細(xì)胞β-半乳糖苷酶的表達(dá)。 3、生理濃度的睪酮使早衰的心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降。 4、生理濃度的睪酮能夠抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞的TGF mRNA、P16mRNA、cyclinD1 mRNA的表達(dá)。 5、生理濃度的睪酮能夠抑制氧化應(yīng)