FLUTAX法顯示纖毛蟲微管胞器的改良及一種游仆蟲細胞周期中微管胞器及其蛋白組分的研究.pdf

1、本文在參考Arregui等報道的方法的基礎上，對熒光紫杉醇染色(FLUTAX)顯示纖毛蟲細胞微管胞器的流程進行了改進，對其中一些試劑的配方作了調(diào)整，改進了多聚賴氨酸涂布玻片、皂苷孵育、多聚甲醛固定和TritonX-100滲透等步驟。按照改良的FLUTAX染色方法，以FLUTAX為探針跟蹤標記了一種腹毛類纖毛蟲游仆蟲(Euplotessp.)的微管胞器和相關的結(jié)構(gòu)微管的形態(tài)及其在生命周期不同時期的變化。無性生殖過程中，腹部纖毛器包括口圍帶

2、、波動膜、額腹橫棘毛和尾棘毛發(fā)生瓦解，新纖毛器在細胞皮層的特定位置發(fā)生，從相應纖毛器原基的發(fā)生、組排和遷移，至最終形成前、后兩套新的纖毛器，新結(jié)構(gòu)的形成和老結(jié)構(gòu)的瓦解是一個相伴隨的過程。背面纖毛器的發(fā)生中，新纖毛原基在老纖毛基體后發(fā)生，最終形成前、后兩套新背纖毛。根據(jù)游仆蟲在無性生殖過程中微管胞器的分化特征，推測，微管胞器在纖毛蟲生命活動不同時期發(fā)生了連續(xù)的變化，是細胞生命活動中的至關重要的結(jié)構(gòu)；在形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)分化的過程中，先存微管結(jié)

3、構(gòu)對新結(jié)構(gòu)的形成可能有物質(zhì)貢獻，并且具有結(jié)構(gòu)誘導和模式定位的作用。 應用α微管蛋白抗體和γ微管蛋白抗體標記不同時期游仆蟲微管胞器的發(fā)生過程。α微管蛋白抗體具有較強的特異性，與游仆蟲胞器及骨架中的α微管蛋白特異性結(jié)合，跟蹤標記了游仆蟲在細胞間期和分裂期的纖毛器骨架及胞器微管的發(fā)生、遷移、定位。間期細胞除其基體胞器被標記，在游仆蟲背部可見明顯的皮層網(wǎng)格和背觸毛外，還發(fā)現(xiàn)細胞腹部和背部均被較細的縱向纖維包裹，構(gòu)成較復雜的纖維網(wǎng)絡。細胞

4、分裂期，游仆蟲腹部棘毛從產(chǎn)生原基到新纖毛器成熟直至遷移定位，這一系列過程似乎都與老纖毛器及其基體有著密切聯(lián)系；背觸毛的發(fā)生可能是在老背觸毛基體的指導下完成的，老背觸毛可能起了模板作用。γ微管蛋白抗體應特異地與γ微管蛋白結(jié)合，但實驗結(jié)果顯示，該抗體特異性不高，標記不明顯，推測與γ微管蛋白抗體本身特異性不強有關。本實驗應用的抗體為鼠源抗體，可能是種屬差異太大，導致特異性不高。 此外，利用三種微管蛋白抗體分析游仆蟲微管蛋白的主要成分：

5、α微管蛋白、β微管蛋白和γ微管蛋白。本實驗中用到的一抗包括：鼠抗α微管蛋白抗體(Sigma)，鼠抗β微管蛋白抗體(Sigma)，鼠抗γ微管蛋白抗體(Sigma)和兔抗γ微管蛋白抗體(Abcam)。實驗結(jié)果顯示：α、β微管蛋白分子量均為55KD左右，在游仆蟲體內(nèi)表達穩(wěn)定，且與抗體結(jié)合特異性較好；兩種γ微管蛋白抗體對游仆蟲體內(nèi)的γ微管蛋白標記都不是很清晰，其中，SIGAMA抗體標記較弱，幾乎看不到明顯的目的條帶，而ABCAM的抗體非特異性條