艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性研究及其化學成分分析.pdf

1、艾葉為菊科多年生草本植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥葉，我國大部分地區(qū)都有分布。艾葉是我國歷史悠久的常用中藥，實驗證明其具有抗菌抗病毒、平喘鎮(zhèn)咳祛痰、止血與抗凝血、抗過敏、鎮(zhèn)靜、免疫、抗自由基等藥理作用。艾葉抗乙肝病毒的活性、有效部位及有效部位化學成分研究未見報道。
　　 為了研究艾葉抗乙肝病毒有效部位新藥，本研究前期對艾葉不同極性提取部位進行了抗乙肝病毒活性初步篩選，發(fā)現(xiàn)艾葉揮發(fā)油和乙

2、酸乙酯提取物對體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用。基于此，本課題進行了艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性的體內、外實驗確證，利用正交試驗法對揮發(fā)油提取工藝進行了優(yōu)化。研究所用河南駐馬店產艾葉揮發(fā)油化學成分未見報道，鑒于環(huán)境和氣候條件的差別會對不同產地的艾葉揮發(fā)油化學成分有明顯的影響，從而影響其藥理活性，我們采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法對其化學成分進行了分析，進一步明確了其抗乙肝病毒活性的物質基礎。本研究為確定艾葉抗

3、乙肝病毒有效部位，對建立有效成分定性、定量質控方法，并在此基礎上進行艾葉抗乙肝病毒有效部位新藥的研制奠定了基礎。本課題完成如下研究工作:
　　 1、艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性的研究
　　 本課題首次對艾葉揮發(fā)油抗乙肝病毒活性進行研究。將不同體積濃度艾葉揮發(fā)油作用于HepG2.2.15細胞，運用MTT法檢測艾葉揮發(fā)油對HepG2.2.15細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)，酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)檢測其對HepG2.2.15

4、細胞分泌的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表達的抑制作用，以及熒光定量PCR法檢測艾葉揮發(fā)油對HepG2.2.15細胞HBV-DNA拷貝數(shù)的影響。結果顯示艾葉揮發(fā)油對HepG2.2.15細胞有一定毒性，半數(shù)毒性濃度(TC50)為0.069％，不同濃度的艾葉揮發(fā)油對HBsAg和HBeAg均有抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.009％、0.011％，對HepG2.2.15細胞HBV-DNA也有抑制作用，IC50為0.0

5、14％，并呈劑量依賴性，艾葉揮發(fā)油第九天的治療指數(shù)為HBsAg7.7，HBeAg6.3，HBV-DNA4.9。體內抗乙肝病毒實驗采用雛鴨為動物模型，艾葉揮發(fā)油高中低劑量組0.02 mL/(kg·d)、0.004 mL/(kg·d)、0.0008 mL/(kg·d)，灌胃給藥10 d，觀察用藥前(T0)與用藥后(T5、T10)及停藥后3d血清和肝臟中DHBV-DNA表達的抑制作用。結果表明艾葉揮發(fā)油對鴨血清和肝臟中DHBV-DNA有抑制作

6、用。
　　 2、艾葉揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化
　　 水蒸氣蒸餾法提取艾葉揮發(fā)油，采用正交試驗法，以揮發(fā)油得率為考察指標，提取時間(A)、料液比(B)、浸泡時間(C)為考察因素，每個因素設3個水平，對艾葉揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)選。得艾葉揮發(fā)油最佳提取工藝為:料液比1∶10，浸泡4h，蒸餾3h。
　　 3、艾葉揮發(fā)油的GC-MS分析
　　 本研究首次對河南駐馬店產艾葉揮發(fā)油化學成分進行分析。應用GC-MS對其分離

7、鑒定，歸一化法測定其相對含量。檢出103個色譜峰，鑒定了69個化合物，占揮發(fā)油色譜峰總面積的96.01％，其中(Z)-3-甲基-2-（2-戊烯基）-2-環(huán)戊烯-1-酮（茉莉酮）和4-(2，6，6-三甲基-1-環(huán)己烯基)-3-丁烯-2-酮（β-紫羅酮）在艾葉揮發(fā)油中首次報道。河南駐馬店產艾葉揮發(fā)油的主要成分為1，8-桉葉油素(28.59％)、龍腦(7.94％)、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-環(huán)己烯-1-醇(6.56％)、3，3，6-三