應(yīng)用不同分型方法對(duì)布魯氏菌臨床分離株基因分型的研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌（Brucella）屬的細(xì)菌侵入機(jī)體引起的一類全球性分布的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病。該病不僅會(huì)給畜牧業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重危害人類健康。依據(jù)對(duì)宿主偏好性、培養(yǎng)特性以及生物學(xué)特性的不同，將布魯氏菌分為6個(gè)經(jīng)典的種，分別為牛種、羊種、豬種、犬種、綿羊附睪種和沙林鼠種，其中牛種和羊種是最為常見的人布病的病原體。
　　目前布魯氏菌的分型方法主要有表型分型和基因分型，其中基因分型方

2、法在布魯氏菌快速種型鑒定，病原的溯源分析以及菌株之間的差異與聯(lián)系等方面起到了重要作用。本研究旨在尋找一種快速、分辨率高的分型方法，對(duì)布魯氏菌臨床分離株進(jìn)行基因分型，分析菌株的遺傳多態(tài)性，建立菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為我國布魯氏菌病的分子流行病學(xué)和病原溯源研究提供依據(jù)。
　　本研究通過收集臨床分離的23株布魯氏菌，綜合運(yùn)用16S rDNA、AMOS-PCR、改良后的多位點(diǎn)序列分型(Multiple locus sequence ty

3、ping，MLST)以及多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multilocus variable number tandem repeatanalysis，MLVA)等技術(shù)，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行基因分型，分析各方法的特點(diǎn)并探討臨床分離株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。
　　23株布魯氏菌分離株的16S rDNA序列經(jīng)BLAST比對(duì)后，結(jié)果顯示與布魯氏菌的同源性最高，達(dá)到了99％以上。核酸序列相似性達(dá)到了99.85％，但不能區(qū)分種、型。采用AMOS-PCR

4、對(duì)23株布魯氏菌分離株進(jìn)行種型鑒定，其中22株為羊種1、2或3型。1株為牛種1、2或4型。
　　為了提高M(jìn)LST方法的分析效率，本研究通過重新設(shè)計(jì)引物，加長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度，使擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在750bp左右，建立了改良型MLST方法(EMLST)。傳統(tǒng)MLST方法(CMLST)九個(gè)基因的有效序列長(zhǎng)度在422bp至589bp之間，而改良型MLST方法的有效序列長(zhǎng)度在611bp至759bp之間，改良型MLST方法每個(gè)基因參與分型的有效序列

5、長(zhǎng)度增加了121bp-302bp，增加的比例在24.69％-71.56％之間。對(duì)23株布魯氏菌進(jìn)行了CMLST和EMLST的分析，CMLST方法定義了5個(gè)ST型，EMLST方法定義了10個(gè)ST型。九個(gè)基因中，glk、 gyrB和Omp25基因增加了1個(gè)基因型。多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量與該基因型別的多少成正比，通過加長(zhǎng)每個(gè)基因的擴(kuò)增序列，4個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)得到了增加。聚類分析結(jié)果顯示，無論是基因型的分裂分解分析還是進(jìn)化分析，EMLST與CMLS

6、T相比，均具有更多的分支，說明EMLST方法比CMLST方法的分型分辨率更高。國外來自30個(gè)國家的160株布魯氏菌，一共被定義了27個(gè)ST型。本研究23株分離株共有5個(gè)ST型，其中有2個(gè)ST型與國外菌株一致，另外3個(gè)ST型為本研究新發(fā)現(xiàn)ST型，命名為ST28、ST29、和ST30，其中ST28為本研究的優(yōu)勢(shì)ST型。
　　本研究采用測(cè)序的方法對(duì)23株布魯氏菌分離株的16個(gè)多態(tài)性較高的MLVA位點(diǎn)進(jìn)行分析，使用MLVA-8分型結(jié)果顯示

7、，22株為羊種，僅1株為牛種，其中羊種為115型，牛種為117型。使用MLVA-11和MLVA-16分型則沒有發(fā)現(xiàn)與已知序列完全一致的基因型。
　　對(duì)23株布魯氏菌臨床分離株16S rDNA、AMOS-PCR、CMLST、EMLST以及MLVA數(shù)據(jù)綜合分析表明:16S rDNA序列同源性分析能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)布魯氏菌屬的準(zhǔn)確鑒定，對(duì)臨床快速診斷布魯氏菌病有重要作用，但不宜進(jìn)行布魯氏菌的種型鑒定。AMOS-PCR是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的布病