刺參耐高溫品系選育及其性狀評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文以仿刺參（Apostichopus japonicus）耐高溫品系選育基礎(chǔ)研究為目的，研究了溫度對(duì)刺參卵母細(xì)胞體外促熟培育和配子受精能力的影響，測(cè)定了耐高溫品系在高溫脅迫下的免疫、代謝和遺傳特征，評(píng)價(jià)了耐高溫品系選育效果。研究結(jié)果豐富了刺參溫度生物學(xué)內(nèi)容，為刺參耐高溫品種培育提供了理論參考。
　　結(jié)果如下:
　　1.陰干溫度對(duì)刺參卵母細(xì)胞體外成熟和發(fā)育的影響
　　通過(guò)人工解剖獲取刺參性腺，研究了溫度（17℃、21

2、℃和25℃）對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，在17℃和21℃下，生發(fā)泡破裂率最高值分別為92.6-98.6％和91.1-97.5％;能夠發(fā)育到囊胚期的個(gè)體比例分別為87.2-97.4％和80.7-95.4％;發(fā)育到原腸期的比例分別為83.5-87.8％和85.8-88.3％，發(fā)育到耳狀幼體的比例分別為56.2-68.7％和59.6-64.5％。在25℃處理下，生發(fā)泡破裂率、囊胚期、原腸期和耳狀幼體比例最高值依次為66.3-78.5％

3、、53.0-61.0％、44.4-59.9％和31-38.3％。17℃和21℃下各發(fā)育階段的個(gè)體比例均顯著高于25℃。研究表明，陰干可使刺參卵母細(xì)胞順利完成體外成熟和后期發(fā)育過(guò)程，解決了刺參家系構(gòu)建的技術(shù)難題，為刺參卵母細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)研究提供了技術(shù)參考。
　　2.高溫脅迫對(duì)刺參雌、雄配子受精能力的影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)常溫組(18℃)和6個(gè)高溫組(26℃、27℃、28℃、29℃、30℃和31℃)，測(cè)定了刺參雌、雄配子在不同溫

4、度下的受精能力。結(jié)果表明，在18℃下，刺參雌、雄配子在5h內(nèi)受精率均達(dá)94.97％以上，50％的配子失去受精能力的時(shí)間(LT50)為7.03h。在26℃-31℃的高溫條件下，溫度越高，配子失去受精能力的時(shí)間越短;雌、雄配子同時(shí)受到高溫處理時(shí)的LT50顯著小于單獨(dú)受到高溫處理時(shí)的LT50(P＜0.05)，且雄配子單獨(dú)受到高溫處理時(shí)的LT50小于雌配子。研究結(jié)果豐富了刺參配子溫度生物學(xué)內(nèi)容，為應(yīng)用配子選擇進(jìn)行耐高溫品系選育提供了技術(shù)參考。<

5、br>　　3.刺參夏眠和非夏眠群體免疫、代謝和熱休克蛋白表達(dá)分析和比較
　　在夏季高溫期(33-17℃)收集仍處于攝食活動(dòng)狀態(tài)的大規(guī)格（大于150g/頭）刺參為非夏眠群體，停止攝食處于夏眠狀態(tài)的刺參為夏眠群體，比較了兩個(gè)群體體壁抗氧化酶（SOD、CAT和T-AOC）和代謝酶(HK、PK、MDH和LDH)活力、呼吸樹(shù)Hsp70mRNA表達(dá)量以及腸道代謝產(chǎn)物的差異。結(jié)果表明，在水溫較高時(shí)，非夏眠群體體壁各種酶的活力均顯著高于夏眠群體(

6、P＜0.05)，但隨著水溫的下降，這種差異逐漸消失。夏眠群體呼吸樹(shù)Hsp70基因表達(dá)量顯著高于非夏眠群體。在非夏眠群體中，包括支鏈氨基酸在內(nèi)的13種氨基酸、二甲胺、葡萄糖、糖原、肌苷和龍蝦肌堿含量豐富;在夏眠群體中，3-氨基異丁酸、谷氨酸、天冬氨酸、膽堿、膽堿磷酸和?；撬岷控S富。以上結(jié)果表明，非夏眠群體機(jī)體代謝旺盛，具有較強(qiáng)的耐高溫性能，是具有潛在耐高溫能力的優(yōu)質(zhì)親本來(lái)源。
　　4.早期高溫脅迫對(duì)刺參苗種后期耐高溫能力的影響

7、r>　　利用28℃高溫對(duì)耐高溫品系F3代囊胚(HF3-E)、小耳幼體(HF3-S)、中耳幼體（HF3-M）、大耳幼體（HF3-L）和稚參(HF3-Y)進(jìn)行淘汰(淘汰率:40-50％)，以未經(jīng)高溫淘汰的F3(F3)和普通刺參(C)為對(duì)照組，研究早期高溫脅迫對(duì)各組菌種后期（7月齡）耐高溫能力的影響。結(jié)果表明，在30-32.7℃下，各組7月齡苗種的存活率高低順序依次為:HF3-Y＞HF3-L＞HF3-S＞HF3-E＞HF3-M＞F3＞C，各組

8、耐高溫品系F3苗種的成活率均顯著高于C組（P＜0.05），且HF3-L和HF3-Y組成活率顯著高于其他組(P＜0.05)。在28℃下，各組苗種腸道Hap70mRNA表達(dá)量高低順序?yàn)?HF3-Y＞HF3-S＞HF3-M＞HF3-L＞F3＞HF3-E＞C，且HF3-Y、HF3-S和HF3-M組Hsp70mRNA表達(dá)量均顯著高于C組（P＜0.001）。結(jié)果表明，在稚參階段實(shí)施高溫淘汰可獲得更有效的選育效果，該研究為刺參耐高溫品系選育提供了技術(shù)

9、和理論參考。
　　5.高溫脅迫對(duì)刺參耐高溫群體與普通群體主要免疫酶活力的影響
　　在室內(nèi)模擬池塘夏季高溫環(huán)境，比較了耐高溫品系F3代（F3組）和普通刺參（C組）1齡參（13.6±1.8g/頭）在25-33℃下體壁抗氧化酶（SOD、CAT和T-AOC）、水解酶（ACP和AKP）和溶菌酶(LSZ)活力的差異。結(jié)果表明，兩組刺參SOD活力均隨溫度的上升呈先升高后降低趨勢(shì)，且F3組SOD活力在31℃和32℃時(shí)顯著高于C組（P＜0.0

10、5）;F3組CAT活力總體高于C組，且除25℃和32℃外差異顯著（P＜0.05）;F3組T-AOC活力各溫度下均顯著高于C組(P＜0.05)。F3組ACP活力均高于C組，且除31℃外差異顯著(P＜0.05);在25℃、27℃和31℃下，F(xiàn)3組AKP活力顯著高于C組(P＜0.05)，其余溫度下差異不顯著。兩組LSZ活力均隨水溫的上升呈先升高再降低的趨勢(shì)，且F3組LSZ活力在27-31℃之間顯著高于C組（P＜0.05）。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)定向選

11、育的耐高溫品系F3代對(duì)高溫的耐受能力獲得了提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為耐高溫刺參良種選育提供了理論依據(jù)。
　　6.刺參耐高溫群體與普通群體夏眠期攝食情況監(jiān)測(cè)及其耐高溫能力比較
　　現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)了耐高溫品系F2代（小規(guī)格:13.64±2.72g/頭，大規(guī)格:42.42±7.14g/頭）和F3代（小規(guī)格為13.17±1.67g/頭，大規(guī)格為27.60±3.83g/頭）夏眠過(guò)程的攝食情況，以攝食量與體重的比值(Rfb)為指標(biāo)評(píng)價(jià)了子代苗種對(duì)高溫的

12、耐受性。結(jié)果表明，Rfb在0.003-0.006之間時(shí)，F(xiàn)2代小規(guī)格刺參比普通刺參耐高溫能力提高0.69-1.19℃，大規(guī)格刺參比普通刺參提高0.77-1.00℃;F3代小規(guī)格刺參比普通刺參耐高溫能力提高1.07-1.38℃，大規(guī)格刺參比普通刺參提高0.96-1.30℃。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)耐高溫性狀的定向和累代選育，刺參耐高溫品系對(duì)高溫的耐受性獲得明顯提高。
　　7.刺參耐高溫品系生長(zhǎng)和耐高溫性狀的遺傳力研究
　　采用不完全雙列

13、雜交設(shè)計(jì)，以耐高溫F2代親本建立12個(gè)F3代家系，在苗種三月齡時(shí)經(jīng)24小時(shí)饑餓處理后，選取平均體重為（0.036±0.003）g/頭的苗種200頭，放養(yǎng)到80升塑料水箱內(nèi)，每個(gè)家系設(shè)4個(gè)重復(fù)，每月測(cè)定一次苗種體重。在6-7月齡時(shí)進(jìn)行4次高溫脅迫實(shí)驗(yàn)，測(cè)量并分析4次的平均存活率。結(jié)果表明:父系遺傳效應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性狀影響顯著高于母系，而母系遺傳效應(yīng)對(duì)耐高溫性狀的影響高于父系。刺參體重、生長(zhǎng)率、個(gè)體差異率和高溫存活率的遺傳力分別為45.45％、3