角倍蚜唾液蛋白的研究.pdf

1、蚜蟲以特殊的刺吸式口器取食植物汁液，是重要的農(nóng)林業(yè)害蟲，但也有一些種類如五倍子蚜可以在鹽膚木屬(Rhus)植物上形成蟲癭（五倍子），是重要的資源昆蟲。蚜蟲唾液是蚜蟲與植物相互作用的媒介，在蚜蟲與寄主植物的互作中起著至關(guān)重要的作用，唾液腺是分泌唾液的器官。研究蚜蟲唾液及唾液腺中的蛋白成分，將有助于揭示蚜蟲-植物互作的機制，為控制有害種類的為害和有益種類的利用提供科學(xué)依據(jù)。本文主要以五倍子蚜的主要生產(chǎn)種——角倍蚜(Schlechtendal

2、ia chinensis(Bell))干雌為研究對象，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別對唾液和唾液腺蛋白進行了檢測和鑒定。對用Parafilm雙層膜夾營養(yǎng)液法收集到的角倍蚜干雌唾液運用超濾膜濃縮法進行濃縮富集，對解剖得到的角倍蚜干雌唾液腺運用超聲破碎輔助裂解液裂解的方法進行提取蛋白，對收集、提取到的唾液及唾液腺蛋白進行Bradford法定量檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)檢測，質(zhì)譜檢測得到的數(shù)

3、據(jù)運用Mascot軟件比對豌豆蚜(Acyrthosiphonpisum)蛋白數(shù)據(jù)庫V2.1b進行檢索，分析蟲癭內(nèi)角倍蚜干雌唾液和唾液腺的蛋白種類和組成，為深入分析角倍蚜與寄主植物的互作關(guān)系及蟲癭形成過程提供依據(jù)。主要結(jié)論如下:
　　(1)角倍蚜干雌唾液蛋白提取方法
　　采用雙層膜夾營養(yǎng)液方法，收集角倍蚜干雌唾液，分別采用沉淀劑沉淀、真空冷凍干燥和超濾膜離心三種方進行濃縮，根據(jù)Bradford法蛋白定量、SDS-PAGE和LC

4、-MS/MS3種檢測方法的綜合結(jié)果對3種濃縮方法進行評價。結(jié)果表明:超濾膜法濃縮得到的唾液蛋白在3種檢測方法中的濃度、分離和分析效果均高于其他兩種，在后續(xù)實驗中采用此方法對角倍蚜干雌唾液進行濃縮。
　　(2)角倍蚜干雌唾液腺蛋白收集方法
　　利用解剖顯微鏡，通過對大量角倍蚜干雌的解剖，對解剖角倍蚜干雌的方法進行了優(yōu)化，能夠快速、準確解剖和收集唾液腺。采用超聲破碎輔助裂解液處理唾液腺，通過紫外分光光度計檢測、Bradford法

5、蛋白定量、SDS-PAGE和LC-MS/MS方法對唾液腺蛋白進行定量和分離，成功提取到了唾液腺蛋白。
　　(3)角倍蚜干雌唾液和唾液腺蛋白鑒定
　　對通過LC-MS/MS檢測得到的唾液和唾液腺肽段數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)法方法進行分析，從而對唾液和唾液腺蛋白進行鑒定和分類。通過與豌豆蚜數(shù)據(jù)庫進行比對，角倍蚜干雌唾液腺鑒定出有141個蛋白，唾液鑒定出有31個蛋白，其中唾液和唾液腺有17個共有蛋白。其中包含了主要的唾液蛋白，表明這兩

6、種方法均可以有效提取和鑒定角倍蚜唾液蛋白，其分析結(jié)果可以互相印證。
　　(4)角倍蚜干雌唾液蛋白分析
　　對角倍蚜與另外3種非致癭蚜的唾液蛋白進行比較，有1類為共有蛋白，即氧化還原酶類，表明這類蛋白是唾液的基本功能蛋白，對致癭蚜和非致癭蚜均是如此。共有蛋白的存在還表明目前的唾液提取和分析方法具有較好的穩(wěn)定性。角倍蚜唾液中還具有2類特異的結(jié)合蛋白，且在唾液蛋白中占有很高的比例，因為其他3種非致癭蚜唾液中均沒有鑒定出結(jié)合蛋白，因

7、此推測這些結(jié)合蛋白可能與蟲癭的形成有關(guān)，是今后蟲癭形成機理研究的重點。
　　(5)角倍蚜干雌唾液腺蛋白分析
　　角倍蚜和豌豆蚜唾液腺蛋白中具有6個共有蛋白，表明本實驗方法具有較好的穩(wěn)定性。在141個角倍蚜唾液腺蛋白中，其中有功能注釋的105個，以結(jié)合蛋白的比例最高，與唾液蛋白分析的結(jié)果一致。角倍蚜唾液腺中有4類特異存在的蛋白，且在唾液腺蛋白中占有很高的比例，在非致癭蚜-豌豆蚜的唾液腺分泌蛋白中沒有鑒定出，推測這些蛋白可能與致