附紅細(xì)胞體的16S rDNA分類學(xué)研究及重慶市雞附紅細(xì)胞體的分子流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)寄生于宿主的紅細(xì)胞表面或游離于血漿、組織液及腦脊液中?？筛腥旧窖?、牛、豬、馬、綿羊、鼠、犬、藍(lán)狐、雞等多種動(dòng)物和甚至人類。但對(duì)于附紅細(xì)胞體的分類，一直存在著很大分歧。由于附紅細(xì)胞體具有原蟲的特點(diǎn)，初始將附紅細(xì)胞體屬于原蟲：爾后又發(fā)現(xiàn)其具有立克次氏體目的特性，又將它歸入立克次體目。近年來，一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)附紅細(xì)胞體的分類進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其16Sr DNA與無形體的同源性相對(duì)較遠(yuǎn)，而

2、與支原體目，支原體科的血巴爾通氏體同源性更近，建議將其重新歸入支原體科。2005年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》也將無形體科的附紅細(xì)胞體屬(Eperythrozoon)和血巴通體屬(Haemobartonella)重新歸入支原體科的支原體(Mycoplasma)。隨著人類基因組測(cè)序的完成，后基因組時(shí)代的到來。生物信息學(xué)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。特別是針對(duì)原核生物16S rDNA序列的生物信息學(xué)分析可作為微生物表型分類的有效補(bǔ)充

3、，用于微生物的系統(tǒng)分類研究。本研究利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中豐富的資源，從附紅細(xì)胞體代表株的16S rDNA序列尋找新的分子標(biāo)記，對(duì)附紅細(xì)胞體的分類及附紅細(xì)胞體病的分子診斷進(jìn)行研究。 從NCBI的GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載豬、牛、羊、犬、貓、鼠等動(dòng)物的附紅細(xì)胞體和與之相近生物代表株的16Sr DNA序列(截至2008年5月)，如：血巴爾通氏體及致病性支原體、立克次體，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示，豬、牛、羊、犬、貓、鼠等動(dòng)

4、物的附紅細(xì)胞體與血巴爾通氏體的同源性相對(duì)較近，與部分常見致病性支原體形成三個(gè)并列的分支，而與立克次體同源性相對(duì)較遠(yuǎn)。 對(duì)3株豬附紅細(xì)胞體(M．suis)及3株牛溫氏附紅細(xì)胞體(M.wenyonii)代表株的16Sr DNA序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析后，在高變區(qū)內(nèi)選出一段堿基差異較大的片段(約40bp)(后經(jīng)分析該片段位于16S rDNA高變區(qū)V9)。進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)種的種間構(gòu)象有明顯區(qū)別，M.suis種內(nèi)幾乎無差異

5、，M．wenyonii種內(nèi)差異較明顯，說明在豬、牛附紅細(xì)胞體16SrDNA的各種間高變區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的異同不完全依賴一級(jí)結(jié)構(gòu)的組成，即二級(jí)結(jié)構(gòu)相同的序列，其一級(jí)結(jié)構(gòu)可能相同也可能不同。(或一級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異可能造成二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)差異，也可能不出現(xiàn)差異。)因此，二級(jí)結(jié)構(gòu)可能體現(xiàn)出一級(jí)結(jié)構(gòu)無法表現(xiàn)的差異。 對(duì)幾種附紅細(xì)胞體及近緣種血巴爾通氏體的16S rDNA進(jìn)行的RFLP模擬分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)限制性酶切圖譜分析后，篩選出Alu Ⅰ、Dde Ⅰ

6、、Hae Ⅲ、Hha Ⅰ、HinfⅠ、HpaⅡ(Msp Ⅰ)、Rsa Ⅰ、XbalⅠ等8種內(nèi)切酶，通過一種或幾種酶切帶型的組合，基本可用于進(jìn)行生物的種一級(jí)分類單位的比較分析。同時(shí)，用8種內(nèi)切酶對(duì)這些種的16S rDNA所進(jìn)行的模擬酶切(大于100bp)，篩選出可區(qū)分附紅細(xì)胞體與血巴爾通氏體的16 S rDNA RFLP候選分子標(biāo)記。 2根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中附紅細(xì)胞體代表株的16S rDNA序列，設(shè)計(jì)附紅細(xì)胞體的具有屬特異性的引物

7、，分別從鏡檢呈附紅細(xì)胞體陽性的豬血和雞血中擴(kuò)增出兩條約700bp的目的條帶，經(jīng)克隆測(cè)序鑒定為目的條帶。通過優(yōu)化Mg2+濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)等PCR反應(yīng)條件，建立了附紅細(xì)胞體的屬特異PCR診斷法。優(yōu)化反應(yīng)條件后的PCR，經(jīng)特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)，結(jié)果證明該法特異性強(qiáng)，敏感性高，可用于對(duì)附紅細(xì)胞體病的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。 本研究根據(jù)重慶市各區(qū)縣雞的養(yǎng)殖方式及不同地理位置和地形特征，并參考2006年重慶市各區(qū)縣雞的養(yǎng)殖情況，選擇