細胞內(nèi)功能性活性物種（自由基、金屬離子）的新型熒光探針的設計合成及其可視化成像分析.pdf

1、動植物體內(nèi)存在著大量的微量或痕量的活性物種(自由基、金屬離子)，它們對生命過程具有著重要的影響，具有特殊的生理功能。它們既是生物體所必需的物質(zhì)，但在某些環(huán)境(如脅迫)下又會給生物體帶來損傷。如果想要詳細了解它們的生物學功能，就必需能夠及時準確地對其進行檢測。但又由于生物成分本身的多樣性、復雜性，對這些微量生物分子的研究就必須采用專一選擇性、高靈敏度的分析方法。因而發(fā)展選擇性好、靈敏度高的分子熒光探針，對動、植物活體細胞中的活性物種動態(tài)、

2、原位可視化成像分析是目前生命科學研究的重要熱點領域之一。 在活性物種中，活性氧(ROS，Reactive Oxygen Species)自由基中的脂質(zhì)氫過氧化物(ROOH)一直受到人們的廣泛關注，脂質(zhì)氫過氧化物出現(xiàn)在脂質(zhì)過氧化的早期，并迅速降解成烷烴、羰基化合物等產(chǎn)物，對它的準確檢測能夠為脂質(zhì)過氧化過程的研究提供有利的證據(jù)；羥基自由基(OH)是生命新陳代謝過程產(chǎn)生的活性氧中，目前已知氧化性最強的自由基，它進攻產(chǎn)生位點的蛋白質(zhì)、脂

3、質(zhì)和DNA，進而引發(fā)次級的自由基反應，導致無法修復的細胞損傷；因此開展ROOH與OH動態(tài)、原位檢測不但是生命科學研究所迫切需求的，同時也是化學研究中的熱點與難點。此外，鐵是生物體所必需的金屬元素，但是研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)的螯合的鐵被認為對多種細胞損傷是一個決定性的致病因子，尤其是細胞胞漿內(nèi)痕量的亞鐵離子能夠催化Fenton反應，產(chǎn)生氧化性極強的羥基自由基；如果想要對Fe2+的生物學功能深入的了解，就必需發(fā)展出高選擇性、高靈敏度的新型檢測方法

4、。 本論文為了高選擇性、高靈敏度快速識別和檢測動植物細胞內(nèi)脂質(zhì)氫過氧化物、羥自由基和亞鐵離子，開展了以下三個方面的研究工作： (一)設計合成了一種含有非共軛“前花菁”的新型近紅外熒光探針TCP(tricarbocyanine diphenylphosphine)，用于活細胞中脂質(zhì)氫過氧化物的“可視化"。脂質(zhì)氫過氧化物對探針中的含磷五元環(huán)進行親核取代反應，導致五元環(huán)打開，從而恢復花菁的共軛結(jié)構，產(chǎn)物具有強熒光。探針的熒光激

5、發(fā)和發(fā)射最大波長都位于近紅外區(qū)，能夠有效地避免生物系統(tǒng)中背景熒光的干擾，探針對脂質(zhì)氫過氧化物能夠高選擇性地快速響應，而且不受其他活性氧和一些生物體內(nèi)物質(zhì)的影響，分析方法的檢測限為38 pM。結(jié)合共聚焦熒光顯像，探針還實現(xiàn)了脂質(zhì)氫過氧化物在活的巨噬細胞、正常的人體肝細胞和肝癌細胞中的“可視化"。此外，通過MTT毒性實驗證明探針是低細胞毒性，而且探針的性質(zhì)相當穩(wěn)定，結(jié)果為動、植物其它細胞中脂質(zhì)氫過氧化物的分析提供了理想的探針與分析方法。

6、 (二)基于順磁性的哌啶醇氮氧自由基(TEMPO)與熒光團BODIPY之間分子內(nèi)電子交換導致其熒光猝滅的機理，將TEMPO與BODIPY通過共價鍵結(jié)合起來，設計合成了一種新型熒光探針rEMPO-BDP以檢測生物體系內(nèi)的羥基自由基。檢測的原理是羥基自由基能夠與DMSO快速反應生成甲基自由基，探針與甲基自由基結(jié)合后的產(chǎn)物發(fā)出強熒光。在模擬生物體系中，探針能夠迅速地、高選擇性地對羥基自由基進行定量檢測，分析方法的靈敏度高，檢測限為18pM

7、。探針還被成功地應用于未經(jīng)PMA刺激和經(jīng)過：PMA刺激的活的小鼠巨噬細胞中，對所產(chǎn)生的羥基自由基進行了特異性的識別檢測，實現(xiàn)了羥基自由基在活細胞內(nèi)的“可視化"，并且證明了探針的低細胞毒性。此外，探針還分別對正常的和博萊霉素誘導產(chǎn)生肺組織纖維化的以及治療后的大鼠的胸腔灌洗液，進行了羥基自由基的有效測定，從而證明了該探針是動、植物樣品及細胞中OH檢測的理想探針。 (三)本論文設計合成了一種連有兩個噻吩的BODIPY結(jié)構的熒光分子探針