納米硒對(duì)雄性SD大鼠抗氧化、生殖功能的影響及毒性機(jī)理研究.pdf

1、本課題應(yīng)用納米技術(shù)成功構(gòu)建了以殼聚糖為模板的硒納米微粒(SeNPs)，并通過TEM、AFM、SEM、紅外光譜等各種技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行表征，證實(shí)制備得到了平均粒徑為79.88 nm，表面電荷為+29 mV的分布均勻、大小較一致的近圓形的較為穩(wěn)定的納米顆粒。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用制備得到的納米硒，以雄性SD大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，通過活體灌胃、肝細(xì)胞培養(yǎng)等三個(gè)試驗(yàn)，研究了SeNPs對(duì)雄性大鼠抗氧化、生殖功能的影響及毒性機(jī)理。初步探討超營(yíng)養(yǎng)劑量即高于營(yíng)養(yǎng)劑量

2、的SeNPs的添加對(duì)雄性大鼠抗氧化和生殖功能的影響，篩選出最優(yōu)的添加劑量。并在毒性劑量下研究SeNPs在體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)和作用靶器官，通過細(xì)胞活性測(cè)定、流式細(xì)胞凋亡和相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)水平等手段檢測(cè)SeNPs對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的毒性作用機(jī)理，為SeNPs的臨床和生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論參考。
　　試驗(yàn)一:選擇40只5周齡的健康雄性SD大鼠，分4組，分別灌服0、0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs，每天一次，連續(xù)灌胃兩周，試驗(yàn)結(jié)

3、束后麻醉處死，取相關(guān)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果表明:
　　(1)灌胃超營(yíng)養(yǎng)劑量的SeNPs兩周后，0.2、0.4 mg/kg BW的SeNPs促進(jìn)了大鼠的生長(zhǎng)，而0.8mg/kg BW的SeNPs對(duì)體重沒有產(chǎn)生顯著影響。
　　(2)0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs灌胃處理組的IgG水平均較對(duì)照組顯著升高。0.8 mg/kgBW SeNPs處理組的IgM水平較對(duì)照組有顯著升高。0.4 mg/kgSeNPs組的C3

4、、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ均較對(duì)照組有顯著升高，0.8 mg/kgSeNPs組的C3、C4和IL-2也較對(duì)照組有顯著升高。因此三個(gè)劑量SeNPs對(duì)大鼠的免疫功能均有不同程度的促進(jìn)作用，且以0.4 mg/kg SeNPs組最為顯著。
　　(3)0.2、0.4、0.8 mg/kgBW SeNPs處理均顯著提高了血清中RT3、FT3的水平，而對(duì)血清中FT4和TSH的水平?jīng)]有顯著影響。此結(jié)果揭示了在超營(yíng)養(yǎng)劑量下，SeNP

5、s對(duì)于甲狀腺功能有促進(jìn)作用。
　　(4)對(duì)血清中抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，0.8 mg/kg劑量組的T-GSH值較對(duì)照組顯著升高，0.2、0.4 mg/kg劑量組H2O2的值較對(duì)照組顯著降低，而三個(gè)劑量組其他指標(biāo)沒有顯著影響。本研究結(jié)果揭示了在超營(yíng)養(yǎng)水平下，SeNPs對(duì)血清的抗氧化能力提高的程度不太明顯，但有改善的趨勢(shì)，且有劑量依賴性。
　　而對(duì)不同組織中抗氧化功能的檢測(cè)結(jié)果顯示，灌胃超營(yíng)養(yǎng)劑量的SeNPs使肝臟和腎臟的抗氧

6、化能力有所提高，且提高的幅度以腎臟較為明顯，而對(duì)于心臟和睪丸的影響較小，因此，納米硒對(duì)于各組織臟器的抗氧化反應(yīng)具有組織差異性。
　　(5)0.8 mg/kgBW劑量組肺臟的濕重較對(duì)照組有顯著升高，且肺臟指數(shù)也較對(duì)照組顯著升高;其他各臟器指數(shù)與對(duì)照組均無顯著差異。可以推測(cè)0.8mg/kgBW SeNPs對(duì)于肺臟產(chǎn)生了一定的毒性作用。
　　(6)對(duì)大鼠繁殖性能的研究結(jié)果顯示，0.2、0.4 mg/kgBW SeNPs組血清中睪酮

7、含量較對(duì)照組沒有顯著差異，而0.8 mg/kgBW SeNPs處理組較對(duì)照組顯著升高，說明其促進(jìn)了睪酮的分泌。三個(gè)劑量組的SeNPs對(duì)于睪丸組織中LDH、ACP、AKP酶的活性均沒有產(chǎn)生顯著的影響。對(duì)精子活力和精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，0.8 mg/kgBW SeNPs以下的處理劑量對(duì)于精子的活力和運(yùn)動(dòng)力有很好的促進(jìn)作用。
　　(7)0.2、0.4、0.8mg/kg灌胃劑量的SeNPs使肝臟中GPX1和GPX4的mRNA表達(dá)量均

8、較對(duì)照組極顯著升高，但對(duì)睪丸中GPX1和GPX4的基因表達(dá)沒有顯著影響，說明SeNPs對(duì)不同器官組織的作用存在組織差異。
　　試驗(yàn)二:選擇40只6周齡的健康雄性SD大鼠，分4組，分別灌服0、2.0、4.0、8.0 mg/kgBW SeNPs，每天一次，連續(xù)灌胃兩周，試驗(yàn)結(jié)束后麻醉處死，取相關(guān)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果顯示:
　　(1)灌胃毒性劑量的SeNPs兩周后，2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs均顯著抑制了大

9、鼠的生長(zhǎng)，而且血清中肝功能指標(biāo)顯著升高，顯示三個(gè)劑量均對(duì)大鼠產(chǎn)生了一定的毒性作用，且對(duì)肝臟造成了一定程度的損傷。
　　(2)灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs兩周，對(duì)大鼠的甲狀腺功能沒有顯著性影響，4、8 mg/kgBW的SeNPs使外周血T淋巴細(xì)胞和脾臟T淋巴細(xì)胞增殖顯著降低，即4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs使大鼠免疫功能受損，而2.0mg/kgBW的SeNPs則使血清中IgM、IgG、IL-6均

10、有顯著升高。
　　(3)灌胃8.0 mg/kgBW劑量的SeNPs使血清、肝臟、腎臟、心臟和睪丸組織的抗氧化能力明顯降低，4.0 mg/kgBW劑量的SeNPs也使血清、肝臟、心臟的抗氧化功能受到不同程度損傷，抗氧化能力降低，體內(nèi)的過氧化產(chǎn)物升高。并且從抗氧化指標(biāo)來看，大鼠的睪丸組織較其他組織對(duì)于過量的SeNPs的耐受性稍強(qiáng)，其次是腎臟、心臟。肝臟對(duì)于SeNPs的毒性最敏感。
　　(4)對(duì)臟器指數(shù)的檢查結(jié)果顯示:在8 mg/

11、kgBW處理組的毒性劑量下肝臟、腎臟、肺臟和脾臟指數(shù)均較對(duì)照組顯著升高，而心臟指數(shù)、睪丸指數(shù)和胸腺指數(shù)則較對(duì)照組顯著降低，2 mg/kgBW處理劑量下的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)也較對(duì)照組顯著升高，4 mg/kgBW處理劑量下的腎臟指數(shù)顯著升高，而胸腺指數(shù)顯著降低。
　　對(duì)臟器組織的病理檢查結(jié)果顯示:在8 mg/kgBW處理組的毒性劑量下，肝臟出現(xiàn)細(xì)胞壞死、崩解，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，有少量淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤(rùn);腎臟中腎小球萎縮并且有漸進(jìn)性細(xì)胞

12、壞死的發(fā)生;肺泡內(nèi)有充血，且支氣管腔上皮內(nèi)膜增厚;胸腺的髓質(zhì)和皮質(zhì)界限不清晰，以及有炎癥細(xì)胞的大量浸潤(rùn);睪丸組織中曲細(xì)精管大部分退化萎縮，曲細(xì)精管管壁明顯變薄甚至破裂，細(xì)胞層次減少，生精小管直徑變小，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂甚至缺失。2、4 mg/kgBW處理組的組織病理圖片較對(duì)照組沒有顯著變化。
　　對(duì)肝臟和睪丸的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，8 mg/kgBW處理組的肝臟和睪丸細(xì)胞的細(xì)胞間界限模糊，細(xì)胞核變形，細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)濃染、邊聚，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡

13、的形態(tài)。
　　利用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡指數(shù)，結(jié)果顯示2、4、8 mg/kg BW SeNPs處理組的凋亡細(xì)胞明顯較對(duì)照組多，且4、8 mg/kg BW SeNPs處理組的凋亡指數(shù)較對(duì)照組均有極顯著的升高。
　　(5)對(duì)精子質(zhì)量的檢查發(fā)現(xiàn)，精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)有不同程度降低，但顯著提高了睪丸組織中GPX1和GPX4的基因表達(dá)量。
　　試驗(yàn)三:以0.1、0.5、1.0、12.0、24.0、48.0μM六個(gè)不同濃度的S

14、eNPs對(duì)BRL細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示:
　　(1)0.1、0.5、1.0、12.0μM濃度處理組的SeNPs對(duì)細(xì)胞活性有促進(jìn)作用，而超過24.0μM濃度的SeNPs則對(duì)細(xì)胞活性有損害。
　　(2)不同濃度SeNPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1、0.5、1、12μM濃度處理組的GSH-Px、SOD、T-AOC的值均較對(duì)照組有不同程度的升高，而超過24μM濃度的SeNPs使細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px和T-AOC的值顯著降

15、低，MDA的值顯著升高。即大于24μM濃度的SeNPs對(duì)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性有損害。
　　(3)進(jìn)一步研究不同水平SeNPs對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，24.0μM和48.0μM濃度的SeNPs顯著提高了BRL細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率，使與誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase3和Caspase8的活性顯著升高，而對(duì)P53的基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。
　　綜合上述研究結(jié)果得出:0.2和0.4 mg/kg劑量的SeNPs對(duì)大鼠的生長(zhǎng)

16、、免疫、甲狀腺功能以及抗氧化功能有不同程度的促進(jìn)作用，顯著提高了雄性大鼠的生殖功能，其中以0.4 mg/kgBW劑量最為顯著，肝臟中GPX1和GPX4的基因表達(dá)顯著上升;而灌胃2.0、4.0、8.0 mg/kgBW的SeNPs對(duì)大鼠生長(zhǎng)有抑制作用，免疫功能和甲狀腺功能受損，抗氧化能力也有不同程度降低，8.0 mg/kgBW的SeNPs肝臟、腎臟、肺、胸腺和睪丸組織都產(chǎn)生了不同程度的病理損傷，且能誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞的凋亡，精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)也有