2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
   本研究純化天然MBL,研制和純化重組人野生型MBL,從人外周血單個核細胞衍生出DC;研究hMBL/rrhMBL阻遏HCMV感染MD-DC,和阻遏MD-DC將捕獲的HCMV呈遞給T細胞的功能,并初步探討其機制。為明確MBL阻斷HCMV感染的作用和機制,為MBL應(yīng)用于HCMV感染的治療與預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
   材料與方法:
   1.建立rhMBL的CHO細胞株構(gòu)建rhMBL的PIRES2-AcGFP

2、表達載體,參照Ohtaniet al方法并加以改進。用上述載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細胞株,按Transfast說明書配制轉(zhuǎn)染試劑并進行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CHO細胞,用G418篩選抗性細胞即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞,RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株MBL基因的表達,ELISA檢測MBL蛋白。
   2.hMBL/rhMBL的獲得、純化、鑒定和定量CHO/MBL細胞在含20%小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人

3、新鮮血漿進行甘露聚糖-Sepharose4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度,考馬斯量藍進行蛋白定量。
   3.MD-DC和T細胞培養(yǎng)通過淋巴細胞分離液分離濃縮外周血單個核細胞,貼壁2小時后除去未貼壁的細胞。在rhGM-CSF和rhIL-4含10%小牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。第3天半量換液,收集培養(yǎng)6天處于未成熟狀態(tài)的MD-DC,參考Svane IM報道方法,經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)和流式檢測DC-SIGN分子表達

4、率;5μg/ml植物凝集素A(PHA)刺激人外周血單個核細胞,衍生為人活化T細胞。
   4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲HCMV功能用PKH26標(biāo)記HCMV,洗滌4次除去未結(jié)合的PKH26,取2×107染色后的HCMV感染與MBL孵育半小時后的5×105MD-DC,反應(yīng)終體積為1ml,PBS洗滌4次除去未結(jié)合的HCMV,用CD209-FITC標(biāo)記MD-DC表面DC-SIGN分子。對照組的MD-DC未經(jīng)MBL

5、孵育。離心取沉淀做成載薄片。采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對HCMV的捕獲情況,并拍照。
   5.MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能在48孔板中,每試驗孔加5×105MD-DC,分別加hMBL/rhMBL到終濃度1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,加完全培養(yǎng)基在37℃,5%C02孵箱中孵育半小時。
   6.MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能在48孔板中,取MD-DC(2.5x10

6、5)加入HCMV(2×107DNA拷貝數(shù)),孵育半小時后,4次PBS沖洗,除去未結(jié)合的HCMV,與加入PHA刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%C02孵箱中培養(yǎng),分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PCR檢測HCMV的DNA的量,每孔做5個復(fù)孔,每孔終體積為1ml,對照組不加T細胞。
   7.MBL阻遏MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能在48孔板中,經(jīng)方法5處理的MD-DC(2.5×105)與加入PH

7、A刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%C02孵箱中培養(yǎng),分別于第3天、4天取上清用RT-PCR檢測HCMV的DNA的量,每孔做5個復(fù)孔,每孔終體積為1ml,對照組不加MBL。
   8.采用CD4+免疫磁株分選法分離出CD4+T細胞,按試劑盒操作說明進行。
   9.CD209單抗和CD206單抗阻滯MD-DC呈遞HCMV功能試驗。
   取新收獲的克隆增長的MD-DC和PHA刺激活化的T

8、細胞,在含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%C0?及飽和濕度條件下培養(yǎng),取存活率達95%以上的細胞用于實驗。試驗在48孔板中進行,取MD-DC(2.5×108/每孔)分別與未被熒光標(biāo)記的10μg CD209單抗和10μg CD206單抗【抗甘露聚糖受體(mannan receptor MR)抗體】在37℃孵育15分鐘。加入HCMV(2×108DNA拷貝數(shù)/每孔),37℃孵育2小時后,4次PBS沖洗,除去未結(jié)合的HCMV

9、,與PHA刺激活化后的2.5×105T細胞,用完全培養(yǎng)基在37℃,5%C02孵箱中共同培養(yǎng),每孔終體積為1ml,每組做5個復(fù)孔,對照組不加抗體。試驗分以下3組:
   (1)HCMV組(對照組):MD-DC+HCMV+T細胞
   (2)CD206組:MD-DC+CD206+HCMV+T細胞
   (3)CD209組:MD-DC+CD209+HCMV+T細胞
   分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PC

10、R檢測HCMV的DNA的量;培養(yǎng)上清中HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(%)=培養(yǎng)上清中HCMV DNA量/初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。
   10.PP65+GAM-FITC單色流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)HCMV-PP65的量,參照試劑盒說明書進行。
   11.統(tǒng)計學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,采用單向方差分析,P≤0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
 

11、  結(jié)果:
   1.通過RT-Q-PCR技術(shù)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞目的基因表達效果基因的表達量F=2的-△△ct次方
   △△ct=(待測樣品的目的基因的ct的平均—待測樣本的看家基因的ct的平均)-(對照樣品的目的基因的ct的平均—對照樣本的看家基因的ct的平均),備注:2-△△ct值越大,說明該基因的表達量越高;
   2.獲得大量高純度的hMBL/rhMBL
   從200ml人血漿中純化出320mg高

12、純度的MBL,在1000ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中,能純化到510mg,經(jīng)SDS-PAGE鑒定,經(jīng)SDS還原后的MBL單體的分子量為26KD,MBL經(jīng)SDS還原成單體跑膠未見明顯的雜蛋白條帶,提示純度高。
   3.MD-DC和活化T細胞的培養(yǎng)
   外周血單個核細胞GM-CSF和IL-4刺激后,第6天用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài):可見細胞集落樣生長,折光性強,細胞不規(guī)則,有偽足。用CD209-FITC單色流式細胞儀

13、檢測MD-DC百分?jǐn)?shù)穩(wěn)定表達在85%以上。
   4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲MCV的功能
   MD-DC捕獲了經(jīng)PKH26標(biāo)記的HCMV感染后,用CD209-FITC標(biāo)記MD-DC表面的DC-SIGN分子,然后采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對HCMV的捕獲情況。可見未經(jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲HCMV的量較多,而經(jīng)hMBL和rhMBL孵育后的MD-DC捕獲的HCMV

14、的量明顯減少。表明1Oμg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏作用。
   5.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能
   為探索MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的功能,MD-DC暴露于不同濃度和不同類型的MBL孵育半小時后,再與HCMV37℃孵育2小時后,MD-DC經(jīng)4次PBS洗滌徹底除去未被捕獲的HCMV,熒光定量PCR檢測MD-DC內(nèi)的HCMVDNA的拷貝數(shù)。這代表了被MD-DC捕獲的HCM

15、V DNA的量。與初始加入的HCMV DNA量為對照,捕獲的HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(%)=捕獲的HCMVDNA量/初始加入的HCMV DNA量×100。與未經(jīng)MBL孵育過的MD-DC所捕獲的HCMV DNA量對照,捕獲的HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(%)=MBL孵育后MD-DC捕獲的HCMV DNA量/未經(jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲的HCMV DNA量×100。
   6.MD-DC呈遞HCMV給T細胞的功能
   結(jié)

16、果表明,第3天和第4天試驗組“MD-DC+HCMV+T”組培養(yǎng)上清中HCMV DNA的量較對照組“MD-DC+HCMV”組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.398,P=-0.000;F=16.702,P=0.004)。提示有大量的HCMV在T細胞內(nèi)增值復(fù)制。
   7.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV傳遞功能
   在共培養(yǎng)第4天,同組的5個孔MD-DC和T細胞被收集到1管,共7管,經(jīng)免疫磁株陽性分選法分選出

17、CD4?T細胞,CD3-APC單色流式細胞術(shù)檢測分選前后T細胞的百分?jǐn)?shù)從48%~55%上升到93%~99%;PP65-GAM-FITC流式細胞術(shù)檢測T細胞內(nèi)各組HCMV PP65蛋白量從35.4%~%17.9不等,和熒光定量PCR法檢測T細胞內(nèi)各組HCMV DNA的量從28×103/ml~5.9×103/ml不等。表明MD-DC確實將其捕獲的HCMV傳遞給T細胞,并且HCMV在T細胞內(nèi)能增值。
   結(jié)論:
   1.成

18、功建立分泌rhMBL細胞株(CHO/rhMBL),獲得高純度的rhMBL和hMBL;
   2.成功從人外周血單個核細胞衍生出高表達DC-SIGN的MD-DC;
   3.MD-DC具有捕獲HCMV并將其呈遞給T細胞的功能;
   4.rhMB和LhMBL均能阻遏MD-DC對HCMV的捕獲和呈遞功能,但rhMBL效果較hMBL略差:
   5.MD-DC捕獲HCMV并將其呈遞給T細胞的功能是通過DC-SI

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