非小細胞肺癌VEGF-C表達、MLVD、CK19測定與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及化療敏感性的臨床研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 肺癌是呼吸系統(tǒng)的常見惡性腫瘤,已成為各種腫瘤死亡因為之首。肺癌中80％為非小細胞肺癌,已經(jīng)成為基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究的熱點之一。肺癌由于具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的生物學特性,早期癥狀不明顯,缺乏簡單有效的早期、無創(chuàng)檢查方法,從而造成約70％的肺癌就診患者就診時已經(jīng)進入疾病的晚期,手術(shù)切除率不足30～40％,總的5年生存率不超過30％,治療效果差。導致肺癌患者失去手術(shù)條件主要因為并非是腫瘤生長過大,而是腫瘤轉(zhuǎn)

2、移導致手術(shù)效果差。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度是影響肺癌病理分期和治療后生存時間的主要因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在肺癌的分期、診斷、治療和預后判定中具有重要的臨床意義。所以,探索肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的具體機制已成為當今研究熱點之一。轉(zhuǎn)移程度是影響肺癌病理分期和治療后生存時間的主要因素。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在肺癌的分期、診斷、治療和預后判定中具有重要的臨床意義。所以,探索肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的具體機制已成為當今研究熱點之一。腫瘤細胞通過淋巴管擴散到局部淋巴結(jié)是臨床分期的重要指征。在發(fā)生淋

3、巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤基質(zhì)中,常能發(fā)現(xiàn)淋巴管的增生和擴張,但其分子機制至今尚未充分闡明,淋巴管形成在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚。在過去的幾十年里,由于缺乏明確的淋巴管生成因子及特異的淋巴管標記因子,因此對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究進展緩慢,大多集中在對血管系統(tǒng)的研究上。近年來發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)及其受體VEGFR-3,研究認為VEGF-C是相對特異的淋巴管內(nèi)皮生

4、長因子,與VEGFR-3結(jié)合后可發(fā)生淋巴管內(nèi)皮擴張,促使淋巴管形成,從而為研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制開辟了新的途徑。血管內(nèi)皮生長因子C與其受體VEGFR-3結(jié)合后,具有強大特異的淋巴管生成作用,并認為與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關系。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌患者尤其是非小細胞肺癌患者預后的十分重要的不良因素,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是非小細胞肺癌主要擴散途徑,所以肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷尤為重要。而目前主要的臨床診斷手段-胸部CT卻對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在與否的預測缺乏特異性和

5、敏感性。盡管常規(guī)病理HE染色對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是金標準,但是,對于早期的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移卻缺乏敏感性,對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基礎實驗研究則可能有助于我們找到解決問題的金鑰匙。而隨著VEGF-C作為特異性淋巴管生成因子,促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制的深入研究,對于非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者早期診斷、準確分期、改善手術(shù)方式和術(shù)后治療方案,甚至研制相關新藥,促進腫瘤治療進展將具有重大意義。
　　 本

6、研究通過實時熒光定量RT-PCR、免疫組化和酶聯(lián)免疫法檢測不同組織中VEGF-C表達水平及微淋巴管密度(micro lymphatic vessel density,MLVD)和淋巴結(jié)中CK19mRNA的表達,結(jié)合臨床病理資料進行統(tǒng)計分析,旨在探討VEGF-C的表達與非小細胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的相關性,以及在非小細胞肺癌患者腫瘤組織和外周血中的表達有無相關性,明確能否用外周血中的表達水平來預測腫瘤組織中的表達,尋找一種更簡便的

7、檢測方法,并研究VEGF-C表達水平和腫瘤治療之間的關系,分析其作為腫瘤標記物的意義。
　　 研究材料和方法:
　　 本研究取青島大學醫(yī)學院胸外科2008年3月～2008年10月手術(shù)前沒有施行放療和化療、施行了根治性肺葉切除、系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃、隨訪資料確實的全部NSCLC患者標本資料129例的癌組織、癌旁肺組織(為距腫塊邊緣5 cm以上肺組織)、肺門第10組淋巴結(jié)和同期20例行良性疾病肺切除術(shù)患者正常肺組織作為對照,術(shù)中

8、取新鮮標本組織直徑約為0.5cm,用液氮快速冷凍,-80℃冰箱保存。另取標本直徑約0.5cm行病理科常規(guī)固定石蠟包埋等處理。采取全部NSCLC患者術(shù)前1天,手術(shù)后第7天清晨空腹血5ml,離心保留血清置于-80℃冰箱保存。選擇確診為NSCLC行標準化療(未行手術(shù)治療)患者69例,取化療前1天和第3周期化療前(化療后)1天清晨空腹血5ml,處理同上。本研究應用實時熒光定量RT-PCR法檢測肺癌組織、癌旁組織、部分淋巴結(jié)組織和肺對照組織VEG

9、F-CmRNA表達水平,并進行相對定量計算；應用免疫組化S-P法檢測肺癌組織、癌旁組織和肺對照組織中D2-40標記微淋巴管,并計數(shù)MIND；應用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immune sorbentassay,ELISA)檢測手術(shù)患者手術(shù)前、手術(shù)后和化療患者化療前和化療后空腹血清VEGF-C蛋白含量,應用實時熒光定量RT-PCR檢測淋巴結(jié)中CK19mRNA含量,并對所得數(shù)據(jù)結(jié)合患者臨床病理特征進行統(tǒng)計分析。<

10、br>　　 結(jié)果:
　　 在NSCLC癌組織中,93.0％檢測到VEGF-CmRNA,在不同性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、病理分化程度和病理類型等方面VEGF-CmRNA含量無明顯差別(P>0.05)；VEGF-CmRNA相對含量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中,VEGF-CmRNA相對含量較沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中顯著增高(P<0.01),并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越遠,VEGF-CmRNA含量增高越明顯(p<0

11、.01)。在全部癌組織中均可見到D2-40標記的微淋巴管,MLVD與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型、腫瘤大小、病理分化程度和病理類型未見顯著差異(P>0.05)。MLVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關,隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的增加而相應增加(p<0.01)。MLVD隨VEGF-CmRNA含量增加而增加,兩者成線性相關(r=0.831,p<0.01)。血清ELISA測定VEGF-C蛋白含量是一種有效的檢測方法,其檢測準確性低于腫瘤組織實時熒光定量RT-

12、PCR,沒有顯著差異(P>0.05),但是具有較好的一致性(r=0.848,p=<0.01),可以在NSCLC患者術(shù)前和治療前后隨時監(jiān)測,可以使VEGF-C在腫瘤檢測、腫瘤標志物等意義方面提供有效的臨床推廣實用的檢測手段。血清VEGF-C蛋白含量可以推測腫瘤化療的敏感性,患者在手術(shù)前和手術(shù)后血清VEGF-C蛋白含量變化明顯,具有顯著差異(p=<0.01),相關分析顯示手術(shù)后血清VEGF-C蛋白含量與手術(shù)前其含量存在線性相關(r=0.78

13、,p<0.01),化療效果好的患者化療前血清VEGF-C蛋白含量高,且化療后降低更加明顯,反之,血清VEGF-C蛋白含量較低的患者,化療效果相對較差,化療后隨著癌癥病變進展,化療后血清VEGF-C蛋白含量反而會升高。淋巴結(jié)CK19mRNA檢測較常規(guī)病理檢測有更高的陽性率(P<0.01),并且病理陽性淋巴結(jié)中均有CK19mRNA表達,在病理陰性淋巴結(jié)中有16(16/56,28.6％)例CK19陽性,因而具有更高的敏感性。癌組織中VEGF-

14、C高度表達、MLND明顯增高時,淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移可能最大(25/26,96.2％)；而在癌組織中VEGF-C低表達、MLND較低時,淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的可能小(0/26,0.096)。
　　 結(jié)論:
　　 1、VEGF-C在NSCLC癌組織中過度表達,VEGF-C在癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移密切相關,與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤分化程度和腫瘤病理性質(zhì)無明顯關系。
　　 2、VEGF-C在NSCLC

15、癌組織中過度表達可能刺激微淋巴管形成,導致微淋巴管密度增加,從而促進腫瘤細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,首先形成微轉(zhuǎn)移灶,微轉(zhuǎn)移灶生長、發(fā)展逐漸成為病理陽性的顯性轉(zhuǎn)移。
　　 3、ELISA檢測NSCLC患者血清VEGF-C蛋白含量是一種可行、有效,簡單、易行且易于推廣應用的方法,與癌組織VEGF-C表達具有明顯的相關性,在一定程度上可以代替腫瘤組織的檢測,從而為無法得到腫瘤組織或得到腫瘤組織有困難的病人提供一種更加簡便的檢測方法。
　

16、　 4、VEGF-C過度表達的NSCLC患者,淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移出現(xiàn)可能大,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相對較早,提示手術(shù)應當強化淋巴結(jié)清掃；VEGF-C過度表達的NSCLC患者,化療敏感性高,提示術(shù)后應該盡早施行化療等輔助治療,并且提示化療效果較好。
　　 意義:
　　 1、本研究通過快速高效,定量準確、重復性好以及特異性和敏感性更高的實時熒光定量RT-PCR方法檢測組織中的VEGF-CmRNA,并通過檢測淋巴結(jié)CK19來檢測病理淋巴結(jié)陽性