人發(fā)角蛋白—膠原海綿—聚甲基丙烯酸羥乙酯復(fù)合生物敷料的研制.pdf

1、第一部分 人發(fā)角蛋白-膠原海綿的組織相容性和生物可降解性評(píng)價(jià) 有關(guān)HHK的化學(xué)成分、性質(zhì)，生物學(xué)性能，生物、組織相容性及HHK人工腱的生物力學(xué)性能等，我們的前期研究中已闡明，但其在皮膚組織工程中的應(yīng)用尚鮮有報(bào)道。膠原海綿已廣泛用作皮膚的支架材料，但其易收縮、機(jī)械強(qiáng)度小等缺點(diǎn)依然是亟待解決的課題。 目的：研究HHK-膠原海綿體內(nèi)的組織相容性和生物降解性 方法： 1、用可控性的物理、化學(xué)處理方法制備具有輕(Ⅰ

2、)、中(Ⅱ)、重(Ⅲ)不同處理程度的三種HHK組分材料。 2、用牛跟腱為原料，經(jīng)酸溶解、抽提、離心、鹽析等步驟制備Ⅰ型膠原(經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠(PAGE)電泳證實(shí))，并與6-硫酸軟骨素進(jìn)行初交聯(lián)。3、將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種組份的絲狀HHK以3∶3∶4的比例編織成網(wǎng)孔大小為1×1mm2的網(wǎng)格狀支架，與Ⅰ型膠原蛋白一同置于模具內(nèi)經(jīng)真空冷凍干燥后成膜，制成HHK-膠原海綿膜。 4、將HHK-膠原海綿復(fù)合膜置于0.25％的戊二醛

3、溶液中浸泡再交聯(lián)，反復(fù)漂洗后干燥備用。 5、成品的膠原海綿經(jīng)掃描電鏡觀(guān)察海綿狀結(jié)構(gòu)，測(cè)其孔徑大小。 6、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組：將大小均為1×1cm2的“三”種材料(實(shí)驗(yàn)組植入HHK-膠原海綿，陽(yáng)性對(duì)照組單純植入膠原海綿，陰性對(duì)照組不植入任何材料)分別埋植于21只SD大鼠背部皮膚的真皮與皮下組織之間，以背部正中線(xiàn)為軸，每只大鼠背部制作6處埋植區(qū)域(左右各3個(gè))，每組2處。分別于術(shù)后3天、1周、2周、4周、6周、8周和12周，隨機(jī)

4、選取3只大鼠，行材料及其周?chē)M織取材，常規(guī)H.E.染色、彈性蛋白染色及掃描電鏡觀(guān)察，分析材料的組織相容性、降解情況及對(duì)新生組織的血管化作用。 結(jié)果： 1、HHK-膠原海綿膜材料特性SDS-PAGE電泳圖譜分析所抽提膠原α1(Ⅰ)帶的顏色深度是α2(Ⅰ)帶的2倍。Ⅰ型膠原的三條螺旋鏈為(2α1(Ⅰ)]α2(Ⅰ)。兩次交聯(lián)后的HHK-膠原海綿膜0.1-0.2cm厚，質(zhì)韌，有彈性，隨形性好。掃描電鏡觀(guān)察：粗細(xì)不等的膠原纖維呈不

5、規(guī)則立體多孔狀結(jié)構(gòu)，80％的孔徑平均在150-200μm。 2、HHK-膠原海綿膜的組織相容性和降解吸收 1)移植后大體觀(guān)察：各組均無(wú)創(chuàng)口感染、組織滲液或移植物排斥反應(yīng)。取材見(jiàn)，移植物表面包裹有薄層的纖維囊，不易與周?chē)睦w維組織分離開(kāi)。 2)移植后光鏡下觀(guān)察：HHK-膠原海綿和單純膠原海綿植入早期均有較明顯的炎癥反應(yīng)，以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞為主；第2周，炎癥反應(yīng)明顯減輕，實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞增生活躍，分泌少量膠原，材

6、料周?chē)律軘?shù)量增多。HHK及膠原海綿開(kāi)始降解；第6周，實(shí)驗(yàn)組分泌膠原纖維排列趨于整齊，表皮層愈合良好。HHK材料部分降解，膠原海綿基本消失。實(shí)驗(yàn)組醛復(fù)紅彈性纖維染色可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)條狀彈性纖維；第12周，HHK材料完全降解。 3)電鏡下觀(guān)察，第2周，實(shí)驗(yàn)組材料周?chē)梢?jiàn)膠原纖維和彈性纖維；毛小皮降解、剝離；膠原海綿膜內(nèi)可見(jiàn)血管斷面。 結(jié)論：HHK-膠原海綿復(fù)合膜組織相容性和生物降解性良好，且降解產(chǎn)物對(duì)機(jī)體無(wú)毒、無(wú)免疫排斥反應(yīng)。

7、 第二部分 人發(fā)角蛋白－膠原海綿－聚甲基丙烯酸羥乙酯復(fù)合生物敷料對(duì)深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面的促愈作用 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將HHK－膠原海綿作為敷料內(nèi)層，不用更換；將PHEMA/PD藥物緩釋載體膜作為敷料外層，具有保濕和緩釋藥物的作用可更換。通過(guò)與臨床應(yīng)用較廣的戊二醛豬皮敷料作陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌紗布作為陰性對(duì)照組，比較不同時(shí)期的創(chuàng)面形態(tài)學(xué)及新生組織的變化，創(chuàng)面愈合率及愈合時(shí)間。評(píng)價(jià)HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復(fù)合生物敷料對(duì)深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面

8、的促愈作用及生物活性。 目的：研究HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復(fù)合生物敷料對(duì)深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面的治療作用。 方法： 1、PHEMA的合成以丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯為甲基丙烯酸羥乙酯的反應(yīng)物，以過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，經(jīng)回流、滴加等步驟完成甲基丙烯酸羥乙酯的聚合反應(yīng)。將PD按一定比例溶于乙醇，與制備好的聚丙烯酸羥乙酯載體充分混勻后成膜。將PHEMA/PD膜浸泡于500ml蒸餾水中，用紫外光譜儀于5min，10min，

9、30min，1h，2h，4h，6h……不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定浸提液中PD的含量。 2、大鼠深Ⅱ°燒傷動(dòng)物模型用盛有85℃的熱水，底徑為1.5cm的小燒杯，緊貼于脫毛后的大鼠背部皮膚15s，制備大鼠深Ⅱ°燒傷動(dòng)物模型(經(jīng)病理切片證實(shí))，以背部正中線(xiàn)為軸，每只大鼠左右各制作3個(gè)創(chuàng)面。 3、實(shí)驗(yàn)分組創(chuàng)面制備后3天，對(duì)正中線(xiàn)一側(cè)的3個(gè)創(chuàng)面行切痂、清洗消毒處理，同時(shí)分別覆以實(shí)驗(yàn)組(HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復(fù)合生物敷料)、陽(yáng)性對(duì)照

10、組(戊二醛豬皮組)和陰性對(duì)照組(無(wú)菌紗布組)的三種敷料(以后統(tǒng)稱(chēng)創(chuàng)面處理)，另一側(cè)如法炮制。PHEMA/PD和無(wú)菌紗布隔日換藥，觀(guān)察創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)情況。術(shù)后以創(chuàng)面完全上皮化為標(biāo)準(zhǔn)，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間，于7d，14d和21d計(jì)算創(chuàng)面愈合率。于切痂覆敷料后1周、2周、4周、6周和8周，分別隨機(jī)選取3只大鼠，切取整個(gè)創(chuàng)面及其周?chē)M織，行H.E.染色形態(tài)學(xué)觀(guān)察、新生血管計(jì)數(shù)、膠原纖維及彈性纖維的免疫組織化學(xué)染色觀(guān)察。取標(biāo)本前，將制備的膠原海綿與

11、醫(yī)用藥棉分別進(jìn)行斷尾止血實(shí)驗(yàn)，分別記錄止血時(shí)間及出血量，比較二者的止血效果。 4、數(shù)據(jù)分析用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析方法比較3組的新生血管數(shù)和愈合時(shí)間。重復(fù)測(cè)量方差分析方法分析不同時(shí)間點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率。用獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)比較膠原海綿與醫(yī)用藥棉的止血時(shí)間和出血量。 結(jié)果： 1、PHEMA/PD緩釋實(shí)驗(yàn)48小時(shí)(h)時(shí)，吸光度值最大，其后維持恒定。說(shuō)明PHEMA膜在0-48h隨時(shí)間推移藥物PD不斷釋放，48h釋放

12、完全。 2、大體觀(guān)察SD大鼠背部燒傷后，創(chuàng)口邊緣的正常組織充血明顯，創(chuàng)面輕度腫脹，無(wú)水泡，創(chuàng)面皮膚蒼白無(wú)生機(jī)。傷后2-3日，創(chuàng)面壞死組織形成干硬的暗紅色焦痂。2天后換敷料時(shí)，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組敷料均緊貼創(chuàng)面，濕度適宜。陽(yáng)性對(duì)照組豬皮敷料仍呈灰白色，與創(chuàng)面貼附好，無(wú)浮動(dòng)感。陰性對(duì)照組創(chuàng)面有少量滲血及滲液。 3、光鏡下形態(tài)學(xué)觀(guān)察 1)燒傷后48小時(shí)，大量組織變性壞死，表皮及毛囊上皮細(xì)胞腫脹或缺如，胞漿濃縮，核固縮，細(xì)胞界限不清

13、。膠原纖維變性壞死，排列紊亂。 2)創(chuàng)面處理后2周，各組創(chuàng)面肉芽組織灶形成，成纖維細(xì)胞增殖活躍，并分泌較細(xì)小的膠原纖維填充創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)組較陽(yáng)性對(duì)照組更明顯，陰性對(duì)照組次之。新生組織中可見(jiàn)新生的毛細(xì)血管，實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組較陰性對(duì)照組多(P=0.003,P=0.022P＜0.05)。 3)實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組在創(chuàng)面處理后4周均基本愈合，陰性對(duì)照組過(guò)半例數(shù)愈合。創(chuàng)面肉芽組織明顯增厚。新生毛細(xì)血管增殖旺盛且管腔增大，陽(yáng)性對(duì)照組更明

14、顯。 4)第8周，三組創(chuàng)面均愈合良好。實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組膠原纖維束改造塑形，無(wú)瘢痕形成趨勢(shì)。陰性對(duì)照組愈合的表皮層細(xì)胞對(duì)合不好及真皮層組織排列紊亂。 4、免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 1)創(chuàng)面處理后2w，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面真皮基質(zhì)中，Ⅰ型膠原呈棕黃色細(xì)密條帶狀；且有少量被染成棕黃色細(xì)絲狀的彈性纖維，陽(yáng)性對(duì)照組不明顯，陰性對(duì)照組中無(wú)彈性蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。 2)第4周，實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組均可見(jiàn)真皮基質(zhì)中呈棕黃色粗大的條帶或片狀的

15、Ⅰ型膠原的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。且實(shí)驗(yàn)組彈性蛋白的陽(yáng)性表達(dá)較第2周時(shí)增加。 3)第6周，彈性蛋白的免疫組織化學(xué)顯示，陰性對(duì)照組中僅見(jiàn)散在表達(dá)。 5、創(chuàng)面愈合時(shí)間實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組平均愈合時(shí)間的差異無(wú)顯著性(P=0.387P＞0.05)，而實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的愈合時(shí)間均較陰性對(duì)照組平均愈合時(shí)間短(P=0.000P＜0.05)。 6、創(chuàng)面愈合率實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組在第14和21天的愈合率均較陰性對(duì)照組高(p=0.000P＜0.0

16、5)。實(shí)驗(yàn)組僅在第14天，愈合率較陽(yáng)性對(duì)照組高(p=0.046P＜0.05)。 7、止血時(shí)間膠原海綿止血組的止血時(shí)間及出血量均小于醫(yī)用藥棉止血組(Z=-4.334P=0.000P＜0.05)(Z=-2.468P=0.014P＜0.05)。 結(jié)論：HHK-膠原海綿-PHEMA/PD復(fù)合生物敷料可能通過(guò)誘導(dǎo)真皮內(nèi)未分化間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，并活化成纖維細(xì)胞合成、分泌膠原蛋白和彈性蛋白等。刺激血管形成，在體內(nèi)構(gòu)建組織工