功能化多壁碳納米管與L02細(xì)胞的相互作用.pdf

1、納米材料具有優(yōu)良的物理化學(xué)特性，使得其在眾多領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，但已有的一些研究表明納米材料存在潛在的毒性效應(yīng)，因此在細(xì)胞及分子水平對納米材料的生物效應(yīng)及毒理學(xué)機(jī)制進(jìn)行研究非常有必要。功能化的多壁碳納米管由于其特殊的的理化性質(zhì)，有望在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但其生物安全性問題也逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。就目前來看，有關(guān)功能化的多壁碳納米管的細(xì)胞毒理學(xué)研究還不夠深入，已公開報道的研究結(jié)果也存在著極大的爭議。研究表明功能化碳納米管經(jīng)呼吸，口

2、腔，皮膚或靜脈注射暴露于機(jī)體之后能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，由于肝臟具有首過效應(yīng)，且已有文獻(xiàn)也表明碳納米管能在肝臟中有大量的積累，所以探討功能化碳納米管與正常肝細(xì)胞的相互作用具有重要意義。本研究我們選用人正常肝細(xì)胞系LO2細(xì)胞作為模型細(xì)胞，探討了羧基化壁碳納米管、羥基化壁碳納米管以及未經(jīng)修飾的多壁碳納米管與LO2細(xì)胞相互作用及其機(jī)制，從而為納米材料生物學(xué)效應(yīng)的深入開展提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 具體內(nèi)容主要包括以下幾個方面：
　　

3、 (1)利用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、X-射線光電子能譜儀(XPS)對原始多壁碳納米管(MWCNT)、羧基化多壁碳納米管(MWCNT-COOH)和羥基化多壁碳納米管(MWCNT-OH)進(jìn)行了表征。透射電鏡顯示三種碳納米管平均管徑均為10～20nm，長度均為10～30μm，掃描電鏡顯示碳納米管形貌相似，XPS分析顯示功能化多壁碳納米管分別在289ev和286ev處特征峰峰值明顯增高，說明材料分別修飾上了羧基和羥基。樣品中未

4、檢測出金屬催化劑雜質(zhì)，各樣品純度均大于98％。
　　 (2)研究三種多壁碳納米管對LO2細(xì)胞的毒性。將濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/ml的三種多壁碳納米管分別與LO2細(xì)胞共育24h、48h、72h，采用WST法和CellTiter-Glo（R）發(fā)光法考察碳納米管的對細(xì)胞活力的影響。WST法和CellTiter-Glo(R)發(fā)光法均顯示碳納米管的細(xì)胞毒性作用呈現(xiàn)濃度依賴性并與作用時間具有一定關(guān)系?？偟目磥?，羧

5、基化的多壁碳納米管比原始碳納米管在低濃度的時候具有更好的生物相容性，而后兩者之間差異不顯著。說明細(xì)胞毒性與其表面修飾的化學(xué)官能團(tuán)有關(guān)，并且具有劑量依賴性。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，Hoechst33342染核分析及細(xì)胞凋亡/壞死比例檢測發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管能導(dǎo)致LO2細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，功能化的多壁碳納米管相對原始多壁碳納米管不容易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 (3)研究三種多壁碳納米管對LO2細(xì)胞的氧化應(yīng)激，細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞周期的

6、影響。多壁碳納米管可以誘導(dǎo)活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，增加谷胱甘肽(GSH)的耗竭。碳納米管誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧生成與共育時間有關(guān)：碳納米管與細(xì)胞作用36h以內(nèi)時，細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨時間逐漸增加；36h后細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨作用時間延長逐漸降低。通過GSH-GloTM試劑盒檢測胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的含量發(fā)現(xiàn)，LO2細(xì)胞暴露于200μ/mL的多壁碳納米管24h時，細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著下降；暴露48h時，LO2細(xì)胞內(nèi)GSH含量下降緩慢，

7、提示多壁碳納米管誘導(dǎo)LO2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。乳酸脫氫酶(LDH)的測定結(jié)果顯示多壁碳納米管呈時間、劑量依賴性破壞質(zhì)膜的完整性，增加了LDH的漏出。不同濃度的MWCNT作用LO2細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期分布情況出現(xiàn)輕微的改變，與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)有所上升，G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)下降。說明多壁碳納米管可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，這也可能是其導(dǎo)致細(xì)胞毒性的機(jī)制之一。
　　 (4)研究三種多壁碳納米管對LO2細(xì)胞的線

8、粒體和細(xì)胞凋亡信號通路的影響。結(jié)果顯示多壁碳納米管誘導(dǎo)LO2細(xì)胞的凋亡可通過增加線粒體膜通透性，促使線粒體膜電位(MMP)的降低，使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活Caspase-3和Caspase-9，同時還可以激活細(xì)胞凋亡死亡受體通路關(guān)鍵的酶Caspase-8。這些結(jié)果表明了多壁碳納米管可能是通過線粒體通路和死亡受體通路作用而導(dǎo)致LO2細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)功能化多壁碳納米管不容易通過線粒體途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致其細(xì)胞毒性低