功能化多壁碳納米管對(duì)原代巨噬細(xì)胞的毒性與功能影響的研究.pdf

1、碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）是由卷曲的石墨片層形成的一種一維圓柱形微粒，總體上可分為單壁碳納米管（single-walled carbon nanotubes，SWNTs）、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWNTs）兩種。SWNTs直徑在0．4～2納米，MWNT直徑在2～100納米，它們的長(zhǎng)度可達(dá)微米級(jí)。 碳納米管能與細(xì)胞結(jié)合并能穿透細(xì)胞膜，正是基于這些獨(dú)特性

2、質(zhì)人們致力于碳納米管在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。通過(guò)引入功能化基團(tuán)，功能化碳納米管（functionalized CNTs，f-CNTs）的水溶性和生物相容性得到改善，從而為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，在免疫反應(yīng)的多個(gè)階段發(fā)揮作用，其主要功能是清除異物、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。功能化多壁碳納米管（f-MWNTs）進(jìn)入機(jī)體后，是否會(huì)對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性并影響其生物學(xué)功能目前尚不清楚。我們率先開(kāi)展該領(lǐng)域

3、的研究，并取得了一些初步的成果。 目的： 1、探討商品化多壁碳納米管（p-MWNT）經(jīng)過(guò)不同修飾后得到的83種功能化碳納米管，引發(fā)PMA誘導(dǎo)的THP-1單核巨噬細(xì)胞毒性、細(xì)胞功能影響與其功能化修飾之間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，以毒性差異較為顯著的4種功能化碳納米管作為研究對(duì)象，初步探討其對(duì)原代巨噬細(xì)胞--小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性影響。 2、初步建立人原代單核細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的方法，并觀察單核細(xì)胞在功能化多壁碳納米管（f-

4、MWNTs）的微環(huán)境中分化成巨噬細(xì)胞時(shí)，其表型與功能的變化。 方法： 1．功能化多壁碳納米管對(duì)原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性影響。 1．1 基于組合化學(xué)方法液相合成含有83種f-MWNTs的多壁碳納米管庫(kù)，產(chǎn)物用傅立葉紅外，元素分析及高效液相色譜表征其功能化基團(tuán)。 1．2 f-MWNTs以不同濃度作用于PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖及NO生成情況，初步篩選了p-MWNT和83種f-MWNTs對(duì)P

5、MA誘導(dǎo)的THP-1單核巨噬細(xì)胞的毒性。 1．3 由小鼠腹腔獲得原代巨噬細(xì)胞。 1．4 根據(jù)1．2的初步篩選結(jié)果，挑選出四種不同毒性的f-MWNTs，進(jìn)一步研究其對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響。將選出的四種f-MWNTs以不同濃度梯度與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共孵育，檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生情況。 2．人原代單核細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞方法的建立及功能化多壁碳納米管對(duì)其影響。 2．1 取正常人外周血，密度梯度離心法分離

6、單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），用2h貼壁法獲得單核細(xì)胞（monocytes）。 2．2 粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）誘導(dǎo)單核細(xì)胞，6～7天獲得成熟的巨噬細(xì)胞。 2．3 在2．2所述刺激過(guò)程，同時(shí)加入功能化多壁碳納米管共孵育，觀察所得巨噬細(xì)胞與正常誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞不同。 結(jié)果： 1．功能化多壁碳納米管對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的毒性影響。 1．1 成功獲得了含有83種不同基團(tuán)修飾的多壁碳納米管庫(kù)。

7、 1．2 83種f-MWNTs作用于PMA誘導(dǎo)的THP-1單核巨噬細(xì)胞，當(dāng)作用劑量由50μg/mL增加到200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率由60％左右降至30％左右；其誘導(dǎo)NO的生成不僅具有劑量依賴(lài)性，也與其功能化基團(tuán)有關(guān)。 1．3 顯微鏡下觀察由小鼠腹腔獲得的原代巨噬細(xì)胞具有典型巨噬細(xì)胞形態(tài)。 1．4 f-MWNTs 2＃、43＃、49＃和67＃與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共孵育3～24小時(shí)：1）24小時(shí)后即可在顯微鏡下觀察到

8、f-MWNTs被巨噬細(xì)胞攝入至細(xì)胞質(zhì)的現(xiàn)象。2）2小時(shí)后即可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)ROS升高四種碳納米管在較高作用劑量，大于400μg/mL時(shí)明顯抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的存活率：其中67＃所引起的細(xì)胞毒性最小。 2．人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞方法的建立及功能化多壁碳納米管對(duì)其影響。 2．1 顯微鏡下觀察由人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞具有典型巨噬細(xì)胞形態(tài)。 2．2 顯微鏡下觀察與f-MWNTs共孵育獲得的由人外周血單核細(xì)胞

9、誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞：1）可在顯微鏡下觀察到f-MWNTs被巨噬細(xì)胞攝入至細(xì)胞質(zhì)的現(xiàn)象。2）細(xì)胞形態(tài)明顯變大，胞質(zhì)中有吞噬小泡產(chǎn)生。 結(jié)論： 1．由組合化學(xué)方法得到的功能化多壁碳納米管，其表面修飾基團(tuán)具有高度多樣性。 2．f-MWNTs作用于PMA誘導(dǎo)的THP-1單核巨噬細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)的差別主要由功能化修飾基團(tuán)的不同造成。經(jīng)過(guò)分析，以AC005為修飾基團(tuán)的一組f-MWNTs所引起的免疫反應(yīng)普遍較??；而其他修飾基團(tuán)僅

10、有個(gè)別材料表現(xiàn)出較好的生物相容性。 3．對(duì)于原代巨噬細(xì)胞來(lái)說(shuō)，f-MWNTs引發(fā)的免疫反應(yīng)與修飾基團(tuán)有關(guān)，其影響有弱到強(qiáng)依次為2＃、43＃、49＃、67＃。p-MWNTs僅經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單羧基化修飾后，增加了材料的水溶性的同時(shí)也加劇了其引起的免疫應(yīng)激。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的氨基酸和酰胺基團(tuán)修飾后，其生物相容性大大改善。 4．f-MWNTs作為外源異物作用于巨噬細(xì)胞，在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高。