大熊貓腸道纖維素分解菌的篩選及β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達.pdf

1、大熊貓是我國特有的珍稀野生動物，以富含高纖維素的竹類為主食，但其消化纖維素的能力不佳，主要依賴于其腸道內微生物對纖維素的分解作用，β-葡萄糖苷酶是微生物降解纖維素過程的重要限速酶，不同來源的β-葡萄糖苷酶及其基因在大小、結構以及理化特征上均有不同，本研究從大熊貓腸道內分離篩選得到纖維素分解菌，進一步研究其β-葡萄糖苷酶的活力及影響因素，構建工程菌對β-葡萄糖苷酶基因進行表達，對研究大熊貓腸道微生態(tài)制劑具有重要意義。
　　從雅安碧峰

2、峽野生動物園15只大熊貓糞樣中分離、篩選得到5株具有分解纖維素能力的細菌，分別對5株菌進行形態(tài)學、生理生化鑒定，初步推斷5株菌均為芽孢桿菌，將5株菌與相關菌種的16SrDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)均與Bacillussp.(HM17927.1)處于同一分支上，進化距離最短，該結果與BLAST的結果一致。再結合16SrDNA測定序列對比分析，可確定5株菌均為厚壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌屬(Bacilli)。
　　利用

3、水楊苷法分別測得菌株QY、HH、YH、YY、AA的初始β-葡萄糖苷酶酶活分別為3.65 U/mL、2.43 U/mL、2.51 U/mL、1.36 U/mL、7.32 U/mL。選擇酶活力較高的菌株QY、YH、AA，通過改變菌株的接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH、碳源、氮源等條件進行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)3株菌的酶活力均大幅度提高，分別達到21.83 U/mL、19.05 U/mL、20.77 U/mL。
　　選擇酶活

4、最大的菌株QY為β-葡萄糖苷酶基因提供菌，克隆β-葡萄苷酶基因bglH，大小為1321 bp，利用表達載體pET-22b(+)在大腸桿菌BL21成功進行了bglH基因的轉化和表達，通過對BL21/pET-bglH誘導后上清進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)酶活達到36.3 U/mL。
　　對表達粗產(chǎn)物進行β-葡萄糖苷酶酶學性質研究，結果顯示，表達得到的β-葡萄糖苷酶最適溫度為36℃，最適pH5.5，30℃時熱穩(wěn)定性較好，40℃處理20 min，酶

5、活仍能維持原酶活的60％左右，當在超過50攝氏度的環(huán)境處理時，酶活迅速下降，溫度越高，酶活下降越快。在pH5-6.5范圍內，相對酶活力都較高，在堿性環(huán)境中，酶活降低更快，顯示出更差的穩(wěn)定性，當pH超過8時，基本喪失酶活。
　　本研究結果表明，大熊貓腸道內存在能夠分解纖維素的細菌，通過對細菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，可以提高纖維素分解菌的酶活力，同時對β-葡萄糖苷酶基因的克隆并構建工程菌，成功得到了β-葡萄糖苷酶的高效表達，為以后大熊貓腸道微