對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥致病菌的免疫磁珠捕獲-PCR快速檢測方法的建立.pdf

1、急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）是一種新出現(xiàn)的嚴(yán)重的對蝦病，并且它是由含有毒性質(zhì)粒的弧菌菌株引起的。該病已經(jīng)造成了全世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)的大規(guī)模減產(chǎn)。所以一種高效準(zhǔn)確的檢測方法對于AHPND致病菌的檢測和預(yù)防至關(guān)重要。在本研究中，基于副溶血弧菌OmpU建立了免疫磁珠捕獲-PCR的方法用于檢測AHPND致病菌株。得到的研究結(jié)果如下：
　　首先通過對AHPND致病菌外膜蛋白OmpU進(jìn)行基因克隆，得到基因序列，然后對弧菌OmpU進(jìn)行生物信息學(xué)分

2、析，發(fā)現(xiàn)其在弧菌中高度保守，并且種內(nèi)的保守性更高，存在多個共同抗原表位，所以推測OmpU在弧菌中具有交叉免疫原性，可以作為弧菌免疫分離的靶標(biāo)。
　　進(jìn)一步用已有的副溶血弧菌來源的OmpU的異源表達(dá)重組工程菌對目標(biāo)蛋白進(jìn)行表達(dá)純化及驗證后，制備多克隆抗體。然后用Western blotting和Whole cell ELISA分析副溶血弧菌OmpU在弧菌種內(nèi)及種間的免疫學(xué)特性，結(jié)果顯示副溶血弧菌OmpU抗體能與包括AHPND致病菌在

3、內(nèi)的弧菌產(chǎn)生種內(nèi)、種間的交叉反應(yīng)，與非弧菌細(xì)菌不產(chǎn)生或產(chǎn)生較弱的反應(yīng)，同時Whole cell ELISA也證實了OmpU抗體能夠識別弧菌的OmpU抗原表位。綜合說明弧菌OmpU是一種交叉抗原，可以作為免疫磁珠分離的靶標(biāo)，其抗體可以用來制備免疫磁珠分離弧菌。
　　以外膜蛋白OmpU用作免疫捕獲靶標(biāo)分離AHPND病原體，然后以AHPND質(zhì)粒的兩個毒性基因（pirA和pirB）的特異性片段作為PCR引物，研究建立弧菌免疫磁珠捕獲-PC

4、R檢測體系。本研究首先評價了該體系檢測性能：對制備的免疫磁珠進(jìn)行了捕獲效率的檢測，發(fā)現(xiàn)對于AHPND致病菌的捕獲效率均大于90％，并且純培養(yǎng)的檢測靈敏度均為101CFU/mL；而干擾實驗表明在捕獲緩沖液pH為3至9和鹽濃度為1%至5%之間時免疫磁珠捕獲-PCR檢測體系仍然穩(wěn)定；在非AHPND致病菌存在的情況下檢測靈敏度沒有顯著差異。
　　進(jìn)一步，通過實驗室模擬建立水，沉積物和蝦樣品的人工感染模型，評價了免疫磁珠捕獲-PCR檢測體系