虎杖愈傷組織的誘導(dǎo)及提高白藜蘆醇含量的初步研究.pdf

1、虎杖(Polygonbun Cuspidatum Sieb et zucc)為蓼科蘿屬多年生草本植物，為常用中藥。其主要活性成分白藜蘆醇(Resveratrol)是一種天然抗毒素，是目前研究較為熱門而被認(rèn)為是最有希望的天然化學(xué)防癌劑之一。本文以虎杖地上莖和葉為材料，誘導(dǎo)愈傷組織，建立了離體無性繁殖系，研究了愈傷組織中白藜蘆醇的提取工藝，不同外植體、培養(yǎng)基、光照強(qiáng)度及前體物質(zhì)對(duì)愈傷組織的生長和白藜蘆醇含量的影響。主要研究結(jié)果如下：

2、 1.用正交實(shí)驗(yàn)研究了溶劑種類、時(shí)間、溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響，極差分析結(jié)果顯示，提取溫度是提取工藝過程中最重要的因素，其次是提取時(shí)間，而提取溶劑對(duì)白藜蘆醇提取率的影響最小。綜合評(píng)價(jià)各指標(biāo)，用乙酸乙酯在4℃下提取48 h效果最佳，虎杖愈傷組織中白藜蘆醇的產(chǎn)量可達(dá)到13.241 μg·g<'-1>。 2.通過研究外植體和培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的影響，了解到以莖段作為外植體時(shí)誘導(dǎo)出的愈傷組織生長比葉片快，且其中的白藜蘆醇含量為葉片中的5

3、倍；MS培養(yǎng)基上的愈傷組織增殖最多，其莖段和葉片的鮮重增長率均極顯著高于N6和B5培養(yǎng)基，分別達(dá)到了141.0％和73.8％，但白藜蘆醇含量略低于B5培養(yǎng)基。因此，以MS為基本培養(yǎng)基，虎杖莖段為外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織成愈較高，生長旺盛，維持時(shí)間長，白藜蘆醇含量高，優(yōu)于其他處理。 3.將莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織，分別于暗光(0 1x)、弱光(1340～1560 1x)、強(qiáng)光(3110～3310 1x)三個(gè)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，愈傷

4、組織的生物量隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而增加，強(qiáng)光培養(yǎng)下愈傷組織的生物量達(dá)到了53.682 g·L<'-1>FW，較暗光下高2596，但僅比弱光下高出0.4％。白藜蘆醇含量與光照強(qiáng)度未成正相關(guān)，弱光培養(yǎng)下，愈傷組織中自藜蘆醇的含量顯著高于另外兩個(gè)處理，為140.074μg·g<'-1>DW?？梢姡⒄扔鷤M織對(duì)光敏感，以弱光培養(yǎng)效果最好。 4.添加10～30 mg·L<'-1>濃度的前體物質(zhì)苯丙氨酸后能促進(jìn)愈傷組織生物量的增殖，且表現(xiàn)為

5、20 mg·L<'-1>處理下生物量增殖最多。用Richards方程模擬了愈傷組織的生物量在一個(gè)生長周期內(nèi)的動(dòng)態(tài)積累過程，發(fā)現(xiàn)在不加前體物質(zhì)的情況下，可以得到穩(wěn)健、可靠的估計(jì)，前體物質(zhì)在一定程度上調(diào)節(jié)了愈傷組織的增長情況。由生長速率參數(shù)(K)可知，隨著苯丙氨酸濃度的增加，愈傷組織增長速度加快，極顯著高于對(duì)照，高出16.5倍以上。 5.添加前體物質(zhì)苯丙氨酸能誘導(dǎo)苯丙氨酸裂解酶活性的增高。各處理的PAL活性的變化趨勢基本一致，都在培

6、養(yǎng)的第7 d達(dá)到最大值，PAL的活性表現(xiàn)出隨著添加的苯丙氨酸濃度的增大而升高，A3處理達(dá)到最大值，為97.0 RU·g<'-1>FW，較CK高出81.6％，A2處理較CK高出75.6％，僅A1處理低于CK，與其他處理達(dá)到極顯著差異。7d后，苯丙氨酸裂解酶活性迅速下降，并不再回升6添加前體物質(zhì)苯丙氨酸對(duì)愈傷組織中的可溶性蛋白含量無顯著的影響。在一個(gè)生長周期內(nèi)，可溶性蛋白在第14 d～21 d出現(xiàn)最大值，各處理間未達(dá)到顯著性差異。7添加適量

7、的前體物質(zhì)能延緩虎杖愈傷組織細(xì)胞的衰老，增加愈傷組織的抗性?；⒄扔鷤M織中的MDA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長而增加，在達(dá)到最大值時(shí)，添加前體物質(zhì)后，各處理的丙二醛含量顯著低于對(duì)照?；⒄扔鷤M織中可溶性糖含量的變化趨勢是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，表現(xiàn)為A3>A1>CK>A2，處理間達(dá)到顯著或極顯著差異。8愈傷組織中的白藜蘆醇含量隨著苯丙氨酸濃度的增加而增加，A3處理下，白藜蘆醇的含量達(dá)到最大值，鮮樣、干樣中分別為18.025μg·g<'-1>