根結(jié)線蟲(chóng)寄生真菌資源與淡紫擬青霉PL89的研究.pdf

1、從全省9個(gè)縣(市)18種作物上根結(jié)線蟲(chóng)的雌蟲(chóng)、卵和卵囊上共獲得888個(gè)寄生性真菌分離物，隸屬于26屬，鑒定出17種，3個(gè)變種.其中厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)、茄病鐮孢(Fusariumsolani)和尖孢鐮孢(F.oxysporum)是福建省根結(jié)線蟲(chóng)的寄生性真菌優(yōu)勢(shì)種群，分別占分離物總數(shù)的22.30％、19.14％、17.23％和9.57％.

2、根結(jié)線蟲(chóng)的寄生真菌類型以卵囊寄生真菌為主.從175株厚垣孢普可尼亞菌(P.chlamydosporia)鑒定出厚孢變種(P.chlamydosporiavar.chlamydosporia)143株和串孢變種(P.chlamydosporiavar.catenulata)32株，其中厚孢變種為優(yōu)勢(shì)變種.厚孢變種與串孢變種在自然界中存在的比例為4.47∶1. 構(gòu)建“幾丁質(zhì)平板篩選、幾丁質(zhì)酶活測(cè)定、對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)致病力測(cè)定”的寄生性真菌

3、高效菌株篩選模型，從123株淡紫擬青霉分離物中篩選獲得5株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)高致病力的菌株021117-89(即PL89)、021117-77、021029-27、021020-65、021020-36.采用明膠瓊脂平板法與幾丁質(zhì)平板法相結(jié)合，從175株厚垣孢普可尼亞菌分離物中篩選獲得5株產(chǎn)蛋白酶能力與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶能力均較強(qiáng)的菌株010727-1、021020-30、021120-48、021020-34、021120-81.對(duì)菌株

4、PL89的發(fā)酵生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，PL89液體發(fā)酵的適宜C/N為5∶1，C/N為20∶1有利于PL89固體平板的產(chǎn)孢；碳源濃度對(duì)PL89液體培養(yǎng)大量產(chǎn)孢出現(xiàn)的時(shí)間和持續(xù)的時(shí)間有一定的影響，碳源濃度為1mol·L-1可使液體發(fā)酵大量產(chǎn)孢時(shí)間提前，適宜PL89固體平板產(chǎn)孢的碳源濃度為0.5mol·L-1；菌株對(duì)不同的碳、氮源種類利用能力不同，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的碳源(可溶性淀粉)及有機(jī)氮源有利于PL89的生長(zhǎng)；主要元素缺失對(duì)菌株P(guān)L89的生長(zhǎng)影

5、響很大，其中缺失磷、硫和鎂等元素對(duì)PL89的液體發(fā)酵產(chǎn)孢的減產(chǎn)率分別達(dá)90.8％，90.6％和83.1％，對(duì)固體平板的產(chǎn)孢減產(chǎn)率分別為83.6％，59.8％和58.8％；微量元素添加培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株P(guān)L89對(duì)銅離子和鋁離子較敏感，添加一定濃度的錳離子、鎂離子和元素硼對(duì)PL89液體發(fā)酵的產(chǎn)孢及生物量的形成有顯著的促進(jìn)作用；添加適當(dāng)濃度的維生素葉酸和維生素B2均十分有利于PL89液體發(fā)酵孢子產(chǎn)量的增加. 根據(jù)PL89菌株?duì)I養(yǎng)需

6、求特性，研制了蝦殼粉培養(yǎng)基.通過(guò)單因素試驗(yàn)證明細(xì)度為過(guò)孔徑為149μm標(biāo)準(zhǔn)篩的幾丁質(zhì)粉末對(duì)菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)性最強(qiáng)，同時(shí)添加蛋白胨能使產(chǎn)酶高峰提早、產(chǎn)酶量提高；多因素正交試驗(yàn)確定在添加2g·L-1細(xì)度為過(guò)孔徑為149μm標(biāo)準(zhǔn)篩的幾丁質(zhì)粉末、2g·L-1蛋白胨、1g·L-1KH2PO4、0.5g·L-1MgSO4、0.2g·L-1CaCl2和0.2g·L-1NaCl的培養(yǎng)基中接入經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)活化10d的菌碟，接種量為6×

7、109個(gè)孢子·L·1，500mL搖瓶裝量150mL，在28℃、轉(zhuǎn)速為150r·min-1的條件下培養(yǎng)3d，發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活最高，可達(dá)到0.11U·mL-1. 用菌株篩選模型獲得的PL89菌株具有很強(qiáng)的分解和利用幾丁質(zhì)的能力，適合在以蝦殼為主要成分的蝦殼粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)·通過(guò)對(duì)蝦殼粉的成分進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果表明，蝦殼粉培養(yǎng)基所含的營(yíng)養(yǎng)全面，碳源濃度和碳氮源比率適合；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蝦殼粉培養(yǎng)基比馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基更適宜于菌株P(guān)L89液

8、體發(fā)酵的產(chǎn)孢及生物量的形成；用蝦殼粉作為唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源液體發(fā)酵PL89，發(fā)酵過(guò)程無(wú)需流加營(yíng)養(yǎng)和消泡處理，并且發(fā)酵過(guò)程中蝦殼粉培養(yǎng)基顯示出良好的pH緩沖性能，使用方便、價(jià)格低廉. 建立了“蝦殼粉為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以谷殼、麩皮為固體培養(yǎng)基，固體開(kāi)放式培養(yǎng)，空調(diào)法干燥，無(wú)塵粉碎收孢”的淡紫擬青霉菌株P(guān)L89雙相發(fā)酵工藝體系. 一定條件下，采用蝦殼粉為培養(yǎng)基的液體發(fā)酵技術(shù)可實(shí)現(xiàn)淡紫擬青霉菌株P(guān)L89的微循環(huán)產(chǎn)孢，液體發(fā)酵罐發(fā)酵7

9、2h芽生孢子產(chǎn)量可達(dá)到11.43×108個(gè)·mL-1；菌絲球數(shù)量可達(dá)到7833個(gè)·mL-1.PL89液體發(fā)酵過(guò)程中除可以產(chǎn)生芽生孢子和液生分生孢子外，還能產(chǎn)生一種不易被觀察到的，大小僅為(1.0～1.2)μm×(0.4～0.6)μm的“節(jié)孢子”. 開(kāi)放式固體發(fā)酵7d的產(chǎn)孢量可以達(dá)到85.73～136.67億個(gè)·g-1，實(shí)現(xiàn)快速大量產(chǎn)孢.創(chuàng)制了淡紫擬青霉PL89可濕性粉劑.通過(guò)對(duì)載體、助劑等進(jìn)行篩選，對(duì)影響潤(rùn)濕性和懸浮性的因素進(jìn)行

10、分析，對(duì)可濕性粉劑進(jìn)行配伍，研制出以硅藻土為載體、木質(zhì)素磺酸鈉和NE-2分別作為分散劑和潤(rùn)濕劑的淡紫擬青霉PL89可濕性粉劑.通過(guò)測(cè)定，該制劑的平均潤(rùn)濕時(shí)間為10.24(±0.13)min，平均懸浮率為78.49(±0.54)％，含孢量為1.5(±0.076)×109個(gè)·g-1，在土壤中的滲透能力明顯優(yōu)于未經(jīng)劑型加工的粉劑.該制劑能有效地防治黃瓜和番茄的根結(jié)線蟲(chóng)病，對(duì)黃瓜和番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的相對(duì)防效分別達(dá)到72.5％和76.9％.同時(shí)，菌

11、株P(guān)L89在土壤、植株根際和根表具有良好的定殖能力，菌株還能在植株的根內(nèi)定殖. 試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株P(guān)L89有較強(qiáng)的抗逆性和對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的兼容性.菌株P(guān)L89在pH值4～13范圍內(nèi)的培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)；有較強(qiáng)的耐鹽堿能力；菌株在40℃和50℃條件下的LT50分別為77.1min和45.3min.菌株對(duì)化學(xué)殺線劑益舒寶和除草劑草甘膦的相容性較好，其EC50分別為10.412mg·mL-1和4.399mg·mL-1；對(duì)殺菌劑多菌靈、除草