低能離子注入雙酶產(chǎn)生菌Spj0104的誘變選育研究.pdf

1、合成、半合成抗生素的研究,是探索和開發(fā)新抗生素的最重要的途徑之一。而D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-pHPG)是半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的重要前體,是目前制藥行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)激烈的產(chǎn)品之一,化學(xué)法制備D-pHPG帶來嚴(yán)重的污染和毒害,而酶法是較好的方法。酶法是利用D-海因酶(DHase)將苯海因(DL-pHPH)轉(zhuǎn)化為N-氨甲酰基-D-對(duì)羥基苯甘氨酸(NC-D-pHPG),N-氨甲?；?D-氨基酸酰胺水解酶(DCase)則繼續(xù)將NC-D-pHPG轉(zhuǎn)化為

2、D-pHPG。但現(xiàn)有的菌種產(chǎn)酶活力不高,故選育高產(chǎn)菌株提高酶活以及采用新技術(shù)提高酶利用率具有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　 首先對(duì)出發(fā)菌株Spj0104的酶活水平進(jìn)行了驗(yàn)證,隨之開展低能N+離子注入技術(shù)的研究,對(duì)出發(fā)菌株運(yùn)用單因子實(shí)驗(yàn)以確定最佳能量與劑量,采用正交法對(duì)低能離子注入的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,并在最優(yōu)條件下對(duì)于一次注入后誘變選育獲得的優(yōu)良菌株Spi03和經(jīng)過微波誘變后的優(yōu)良菌株Sp902進(jìn)行了二次離子注入。最后對(duì)于篩選到的高產(chǎn)菌株S

3、p208進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。以下是整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 (1)在顯微鏡下Spj0104呈短桿狀,生長(zhǎng)周期比較長(zhǎng),在0～21h為生長(zhǎng)延滯期；從21h開始,OD600迅速增加,直到57h,不再增大,且保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài),此為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；57～69h OD值相對(duì)穩(wěn)定,處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期。通過HPLC法測(cè)定經(jīng)DHase和DCase催化后生成的終產(chǎn)物D-pHPG的含量,測(cè)定出該菌株的酶活為0.118955 u/mL。

4、　　 (2)在低能離子注入的準(zhǔn)備工作中先要對(duì)待誘變的菌液風(fēng)干處理。在30min時(shí),菌膜完全干燥,至50min時(shí),菌膜徹底干燥。隨著時(shí)間的增加,菌株由于缺乏水分和養(yǎng)料,致使存活率越來越低,所以當(dāng)菌膜吹至30min時(shí)即可進(jìn)行離子注入處理。
　　 (3)對(duì)低能N+離子注入的能量和劑量分別在固定了脈沖和間隔時(shí)間,多次不同劑量重復(fù)的前提下作了單因子實(shí)驗(yàn),確定了最適合的能量為30KeV。在30KeV能量條件下,設(shè)計(jì)了多梯度的劑量,不同劑量

5、下的存活率曲線為“馬鞍形曲線”。在馬鞍形曲線的“馬鞍”兩側(cè)選取了60×1014ions/cm2,80×1014ions/cm2,100×1014ions/cm2,120×1014ions/cm2,140×1014ions/cm2這幾個(gè)劑量,試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮酶活、存活率等幾個(gè)參數(shù),確定最佳劑量為60×1014ions/cm2。在確定了最佳能量和劑量的基礎(chǔ)上,采用了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn),對(duì)能量、劑量、脈沖和間隔時(shí)間進(jìn)行正交優(yōu)化設(shè)計(jì)。得出了

6、最適誘變參數(shù)為:能量20KeV,劑量40×1014ions/cm2,脈沖時(shí)間15S,間隔時(shí)間15S。
　　 (4)一次離子注入后篩選到一株優(yōu)良菌株Spi03,酶活達(dá)到了0.2422 u/mL。再將其在最佳離子注入條件下進(jìn)行二次離子注入誘變,同時(shí)將經(jīng)過微波誘變篩選到的菌株Sp902號(hào)進(jìn)行離子注入處理,分別篩選到了.Sp208酶活為0.3271u/mL和Sp201酶活為0.2382u/mL,分別比原來提高了35.53％和28.41％

7、,
　　 經(jīng)過微波和離子注入復(fù)合誘變的菌株在形態(tài)上變化很大,負(fù)突變株較多。從眾多的菌株中還篩選到一株菌株Sp206酶活為0.1536,雖然總酶活降低,但是DHase的酶活有較大的提高。
　　 (5)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分作了正交實(shí)驗(yàn)和分析,得出了優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為:玉米漿3.0％；葡萄糖1.5％；誘導(dǎo)劑3.0％；氯化鈉0.3％；(NH4)SO40.1％；MgSO40.05％；CoCl20.01％。對(duì)于影響發(fā)酵單位的發(fā)酵條件溫度